实验五. 细胞染色体制备.pptVIP

实验步骤 1.秋水仙素预处理: 收集生长旺盛的细胞1ml，轻轻吹打散，加入秋水仙素1ul，继续培养6-8小时（已完成）； 2. 预处理后的细胞，以1000rpm离心5min，去上清； 3. 低渗处理：加入1ml低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加7ml低渗液，室温下静置20min 4. 预固定：加入3-4滴固定液后，轻轻混匀，避免粘连，1000rpm离心5min，去上清； 5. 固定：沿管壁慢慢加入3ml固定液，2min后用吸管轻轻吹打，使细胞分散，固定10min后， 1000rpm离心5min，去上清； 6. 二次固定：加3ml固定液，吹打均匀，固定10min后，1000rpm离心5min，去上清； 7. 三次固定：重复第6步； 8. 制悬液：去上清后剩0.5ml固定液，用吸管轻轻吹打使其成为细胞悬液； 9. 滴片：将冰冷的载玻片倾斜30℃，吸取细胞悬液距离载玻片至少1m滴于载玻片上，吹散，空气干燥； 10. 染色：在干燥的载玻片上滴Giemsa，染色10min，细水冲洗后，空气干燥； 11. 镜检：在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。 * 组织培养细胞染色体的制备 实验五 实验目的 实验原理 实验试剂与仪器 实验步骤 注意事项 了解组织细胞的培养方法。 掌握染色体标本的制备方法。 一、实验目的 二、实验原理 二、实验原理 处于指数生长期的细胞，经过短期培养后，用秋水仙素处理，可把细胞分裂阻截在中期，再经过低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。 材料：具有很强生长分裂能力的细胞系（Hela细胞、白血病K562细胞、C2C12，BHK细胞等） 仪器：恒温培养箱、离心机、显微镜 培养瓶、移液管、载玻片 试剂：培养液（RPMI1640、M199、DMEM等）、胎牛血清、双抗、NaHCO3、生理盐水、肝素、1.0g/L秋水仙素溶液（0.1%）、低渗液（0.075M/L KCl）、固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)、Giemsa染液 三、实验试剂及仪器 1. 秋水仙素 ①阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。 ②使染色体收缩成一定的形状。 目的 : 获得大量的中期分裂相细胞。 2. Carnoy固定液 新配置的甲醇 ：冰醋酸混合液 (3:1)。 能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果 3. 低渗液（ 0.075M/L KCl ） 低渗的目的是凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不破裂）染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态 4. 染料 （ Giemsa ） 不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和甲醇的混合物，配制后原液储存， 染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。 四、实验步骤 培养液4ml 胎牛血清1ml 培养24小时 每ml培养液 加1ug 继续培养3-5小时 培养 秋水仙素 培养瓶 取样 取1ml培养液于 10ml离心管 1. 1000rpm 离心5分钟 弃上清 离心 2. 加KCl 8ml 混匀 37℃处理20分钟 低渗 3. 预固定 固定 加3-4滴固定液，轻轻吹打后，离心去上清 二次固定 4. 5. 6. 加3ml固定液，2min后轻轻吹打后，固定10min,离心去上清 加3ml固定液，轻轻吹打后，固定10min后，离心去上清 三次固定（同6） 制片 预冷冰片 距离20cm以上 玻片倾斜30℃ 迅速吹气 过火焰 3-5次 7. 8. 9. 空 气干燥 Giemsa 染色10min 细水流冲洗 染色 10. 11. 12. 吹干 镜检 13. 14. 1）秋水仙素处理时间要把握好，时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长 2）低渗之后，要细心、温柔混匀细胞，防止细胞膜破裂、染色体散失； 3) 离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失； 4) 载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将材料滴在玻片上； 五、注意事项 小鼠中期细胞染色体（2N=40） 小鼠染色体核型分析 人类慢性骨髓性白血病（chronic myelogenous leukemia） Chr9和Chr22相互易位 使得Chr9上的c-abl oncogene和Chr22上的bcr gene相连，形成融合基因。 其产物是一个融合蛋白 这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的控制，导致白血病。 只要一个细胞带有这种易位Chr，就会致病。 猫叫综合征（Cat cry syndrome） 临床表现： 喉部