透射样品制备2011研.pptxVIP

透射电镜生物样品的制备TEM Biological sample preparationTEM 生物样品的制备方法普通超薄切片法负染色技术冷冻复型技术免疫电镜技术电镜原位杂交技术第一节 超薄切片法ultrathin sectioning 超薄切片法是最基本、最常用的一项技术，它是其它许多技术的基础。 如：免疫电镜技术、酶电镜技术、电镜放射自显影、分析电镜等。超薄切片法分三步：组织处理、超薄切片和电子染色。一、组织处理目的：将组织材料制成包埋块，使细胞、组织具有适当的硬度、韧性和切割性能，便于切成超薄切片。(一)取材新鲜、快(1-2min)、小(1mm3)、准、冷(4℃)、轻、标记。1.实验动物取材将动物麻醉或处死，立即暴露取材位置，遵循取材原则进行取材。（1）常规取材:1mm3，5-6块。特殊器官：如脑组织、眼球等灌注固定后取材。如为肺组织，应在固定液中充分震荡，使其完全沉到瓶底为止。如组织块带有血液使小瓶内固定液浑浊则应更换新鲜固定液，然后置于4℃冰箱内固定、保存。 （2）需要定位的组织：横切面约1mm2、长约2mm的长条形。如皮肤、粘膜 。2.临床活检取材先取厚度1-4mm大小，然后细切为1mm3,其余同前。（二）固定目的：利用物理或化学方法迅速杀死细胞，尽可能完整地保存细 胞生活状态下的结构和成分。1、理想固定剂的条件：①穿透力强，渗透迅速均匀细胞不变形。②能稳定细胞结构和化学成分保存细胞器的空间位置。③能将细胞内成分变为不溶状态，避免成分的溶解和流失。④能保存酶及其它大分子的活性⑤能增强图像反差。2.良好固定的标准：①膜相结构线条清晰，连续无中断。②细胞基质中充满密度均匀的精细颗粒，无空白区和聚集现象。③细胞核结构（核膜、核仁、染色质）层次清晰，无聚集和异常空白区。3.影响固定的因素1）固定剂的pH值：是最大限度保持细胞酶活性的最重要因素。常用缓冲液为磷酸盐缓冲液、二甲胂酸盐缓冲液、醋酸-巴比妥缓冲液，常用pH值为7.4。2）固定液的渗透压：应与细胞内的渗透压保持平衡，低渗会引起细胞器或整个细胞膨胀，高渗会使细胞收缩。3）固定时间：原则是在尽可能短的时间内完成固定，防止组织结构成分被抽提。4）固定温度：0-4℃可减少死后变化及酶活性的丢失，温度提高可缩短固定时间，但增加细胞自溶的速度，避免在固定期间突然改变温度。5）固定液的浓度：过低导致固定时间过长，会引起细胞成分扩散、抽提、细胞器损伤；过高会使细胞的酶活性丢失。6）固定液的用量：原则是既能达到良好的固定效果，又能节省试剂，一般10-20倍组织块体积。4.常用固定剂⑴四氧化锇：1%,室温1.5h;优： ①不饱和脂肪酸分子形成交联复合物。②氮原子强亲和力，使Pr分子交联。③增强图像。④不变形。 缺：①糖类、核酸固定效果差。②穿透力弱，不宜做细胞化学研究。③醇产生沉淀反应。④固定时间长使组织变脆。⑵戊二醛：2.5%，4℃―4h;优①强亲和力，蛋白交联中发挥作用。②糖原、糖蛋白有保护作用。③渗透力强。④保护酶类。⑤保存时间长。缺：①脂类无固定。②无电子染色作用。注意：充分漂洗，否则醛与锇酸反应产生沉淀⑶甲醛：分子量小，渗透力强，固定迅速，适合结构致密组织；但含有少甲醇和甲酸。多聚甲醛：高分量聚合体，稳定，适合做细胞化学方面的研究：2%多聚甲醛-2.5%戊二醛4℃,4h。⑷高锰酸钾：强氧化剂，固定磷脂蛋白，用于细胞膜性结构的固定。不稳定。5.固定方式1、双重固定法:戊二醛、锇酸。2、体内原位固定法：动物麻醉后，解剖出组织，滴加固定液，硬化后切取。避免缺血造成的损伤。3、灌注固定法：动物血液循环将固定液灌流到所需组织中，使其硬化，切取。适于中枢神经系统、视网膜等柔软组织或难以渗透、死后变化快的组织。（三）漂洗 0.01MPBS(phosphate buffer salt，PBS) 30min×3-6次。（四）脱水 目的：用脱水剂逐渐置换出组织、细胞中游离水分的过程。原因：1.包埋剂为树脂类不溶于水。 2.电镜镜筒内为高真空，若组织内有水会引起样品的急骤变化而无法观察。 常用的脱水剂有丙酮和乙醇，乙醇-环氧丙烷（过渡剂）。（丙酮梯度脱水法）方法：50%-70%-80%-90%-95%-100%（Ⅰ-Ⅲ）15分钟/级。注意事项：1.脱水要充分，不足会影响包埋。2.掌握好脱水时间，过长会加重脂类抽提。3.如需要过夜，放在70%的液体中。（五）浸透浸透的目的是使包埋剂逐渐取代组织内脱水剂的过程。浸透液的配制包埋剂：丙酮=1:3 2~3h包埋剂：丙酮=1:1 2~3h包埋剂：丙酮=3:1 2~3h纯包埋剂2~3h（六）包埋目的：使浸透到组织块内部的包埋剂在一定条件下聚合为包埋块，使细胞、组织获得适当的硬度、韧性和弹性，