病毒TCID50测定技术.docVIP

病毒TCID50测定（组织半数感染量） 操作步骤 准备细胞 取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细 胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。 细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。 (2) 稀释待测病毒液。 A法为参考书上标准的操作方法 B法参照书将液体量减少后的结果 病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。 A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。 B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。 根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500μl，即10-1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。 【！此步操作注意事项： 1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。 2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。 2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】 (3) 接种 取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】 37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200μl继续在37℃ CO2培养箱中培养。 (4) 培养 将培养板放置于CO2培养箱。培养温度 ，培养 天。 (5) 测定结果 取出培养板，显微镜下观察细胞病变。 计算方法 1) Spearman-Karber 法 LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1） X0 = 全部病变最低稀释度对数 d = 稀释因数对数 N1 = 每个稀释度所种的孔数 R1 = 病变孔数 ∑ = 积和 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.7 2) Reed-Muench法 观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50 由表看出，能使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10-5之间，其中间距离比例按Reed和Muench公式计算： TCID50＝高于50%病变的病毒最高稀释度的对数＋距离比例 故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4.5，即TCID50为104.5倍，当病毒悬液做104.5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100 TCID50/0.1ml。 3) 判定标准 细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。