第二节 蛋白质改造的分子生物学途径.pptxVIP

第二节 蛋白质改造的分子生物学途径; 1．寡核苷酸介导的位点特异性突变;(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素;关于DNA模板的制备 双链DNA模板：质粒 单链DNA模板：M13噬菌体载体，足够纯净(避免RNA污染); 寡核苷酸突变引物的设计和选择 引物特征： 具有和模板DNA的互补区； 足够长，能与目标DNA序列退火； 突变引物应尽可能避免形成稳定二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列； 突变引物不能与目标DNA的其它区域和载体DNA形成稳定的杂交体。 引物设计取决于所要产生的突变类型： 用于单个核苷酸改变的引物，一般长度为17－19个核苷酸； 多处改变核苷酸或改变2个以上，一般长度为25个核苷酸以上。;寡核苷酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件 退火条件： 突变引物与模板DNA的摩尔比为10－50；退火通常将二者混合物加热到Tm值以上20度，然后再缓慢冷却到室温；对于A＋T含量高的引物，为保证退火安全，加热后可冷却到较低温度，以稳定模板和引物复合体。 引物延伸条件： 退火完成后加入4种脱氧核苷三磷酸，DNA聚合酶、DNA连接酶等，进行2-15小时的延伸反应。;DNA聚合酶的选择 目前一般选择T4DNA聚合酶;存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响;⑥ 受体细胞对突变体产率的影响; (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 ;① Ku