液体配制及实验方法.docxVIP

（一）液体配制 1. 完全培养基 DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS 液） 若放置时间长于 2 周 加 1%谷氨酰胺 2. PBS 1000ml 去离子水中溶解 8.0gNaCl、 0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO4 3. 胰酶 用之前调节 PH 值至 7.6 4. CaCl 2 将 0.165gCaCl  2  粉末溶于 10ml 去离子水中配制成 50X 的溶液 每 5ml 胶原酶中加入 100μl CaCl 5. 双抗 终浓度：青霉素 100 万 U/100ml 2 溶液（终浓度 3μmol/L） 用于激活胶原酶的活性 链霉素 100 万 U/100ml 青霉素 0.6μg 为 1 个单位 链霉素 1.2195μg 为一个单位 称取青、链霉素粉末各 0.6、1.2195g 溶于 10mlPBS 中 再定容至 100ml 6. 两性霉素 B 100mg 两性霉素 B 粉末溶于 40mlPBS 中，制成浓度为 2.5mg/ml(1000X)的浓缩液 每 100ml 完全培养基中加入 100μl 浓缩液，稀释为终浓度 2.5μg/ml 7. 细胞冻存液 20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS) 8 STZ 溶液 STZ 溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中 称取柠檬酸 0.105g 溶于 5mlPBS 称取柠檬酸三钠 0.145g 溶于 5mlPBS 中 混合两者制成 10 毫升的溶解液. 再将 100mgSTZ 粉末溶于该溶解液中 制成浓度 1%的 STZ 溶液，调节 PH 值至 4.5，4°避光保存，由于 STZ 水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕. 9 油红 O 原液：油红 O 0.6g 溶于异丙醇（ 99% ） 100ml 。 稀释液：油红 O 原液 20ml ，蒸馏水 20ml ，过滤后使用。 10 茜素红 称取 0.1g 茜素红粉溶于 100mlPBS，调节 PH 值到 7.2，过滤后使用. 11 成骨诱导液 配方：DMEM(H)+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+0.1μmol/L 地塞米松+50mg/LVitC 1）β-甘油磷酸钠分子量：216 溶于水 10mmol/L=216mg/100ml 称取 216mgβ-甘油磷酸钠粉末溶于 100ml 低糖完全培养基中 2）地塞米松分子量：392.5 在无水乙醇中的溶解度为 1mg/ml. 0.1μmol/L=0.04mg/L 将 100mg 地塞米松溶于 100ml 无水乙醇中 制成 25000X 的浓缩液 每 100ml 低糖完全培养基中加入 4μl 地塞米松浓缩液 3）VitC 分子量 176.1 溶于水 称取 5mgVitC 粉末溶于 100ml 低糖完全培养基中 12 成脂诱导液 配方：DMEM(L)+10%FBS+10 μmol/L 地塞米松+200μmol/L 吲哚美辛+0.5mmol/L3-异丁基 -1-甲基黄嘌呤（IBMX）+10mg/L 胰岛素 每 100ml 高糖完全培养基中 400μl 地塞米松浓缩液 吲哚美辛分子量：357.79 在无水乙醇中的溶解度为 1g/50ml PH 7.4 以下 0.2mmol/L=7.16mg/100ml 称取 720mg 吲哚美辛粉末溶于 50ml 无水乙醇 制成 200X 的浓缩液 每 100ml 高糖完全培养基中加入 500μl 吲哚美辛浓缩液 3）IBMX 分子量：222.25 在 DMSO 中的溶解度为 1M(222.25mg/ml) 0.5mmol/L=1.1mg/100ml 将 100mgIBMX 粉末溶于 1mlDMSO 制成 100mg/ml(9100X)浓缩液 每 100ml 高糖完全培养基中加入 11μlIBMX 浓缩液 4）Insulin 浓缩液浓度为 10mg/ml(1000X) 每 100ml 高糖完全培养基中加入 Insulin 浓缩液 100μl. 溶解粉末时均需先用少量液体溶解，再定容。 （二）细胞培养 1.骨髓基质干细胞（BMSC）、脂肪基质干细胞（ADSC）的原代培养 1）准备工作 所需液体：培养基，血清（FBS），胶原酶 消毒（器械、烧杯、滤纸、离心管等）（PBS,枪头，青瓶和塞子，5 套器械+3~4 个烧杯 +滤纸，离心管 50+15ml） 水浴锅调节温度至 37°预热 配制 BMSC 清洗液 将 PBS 倒入 50ml 的烧杯中加 2%双抗和 200ul 两性霉素 配制 ADSC 清洗液 由于脂肪组织易污染，故将清洗液装入青瓶中，每 100mlPBS 加 2%双 抗和 20~40ul 两性霉素 配制骨髓冲洗液（PBS+3%FBS）即 300ul 血清 BMSC 冲洗液及胶原酶可放入