自噬研究方法.docxVIP

清所诱导出来的自噬。示作 清所诱导出来的自噬。 示作用，好看些 个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞 现象，但不如国外报道的高。 MDC:取 12 mg 粉末溶于 720 nl DMSO 使其浓度为 50 mmol/L,分装后-20 冰箱保存。 临用前用 MEM 稀释到终浓度 50 umol/L; Rapamycin:用 MEM 培养基配成终浓度为 1 umol/L,现用现配; 400ng/ml 喹乙醇:称取 4 mg 喹乙醇,DMSO 预溶(体积0.1%)后加入 10 ml MEM 培养液至完全 溶解,现用现配,避光保存; 3-MA:首先用 PBS 溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入 MEM 培养基至终浓度 10mmol/L; PI3K 抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成 用 RAPAMYCIN 诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度 从 25nM 到 100nM 都有，用的是 50nM 的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血 文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在 4-6 小时活力达到最大，24h 后以 CMA 途径为主 Earles balanced salts solution (EBSS) for 48 h sigma 的 EBSS，货号 E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个 PH 指 无血清诱导自噬：EBSS 诱导 6 个小时就可以了。 EBSS 一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就 可能开始自噬了，一直到 24 小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一 收养的时候蛋白浓度太小了。24 小时就很少了，更不要说 48 小时和 72 小时了 Hanks 诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以 Hanks 替代常规完全 培养基，3h 后就可诱导出自噬。我用 Hanks 诱导了 3h 后电镜观察有 30%细胞都有自噬这种 sigma 的氯喹的货号 C6628。用氯喹 做自噬抑制剂，293T 细胞 50uM 就可以。1.  可以用双蒸 水配制 2. 配制后 4 度保存 不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制 lc3 的剪切，但能抑制后续的 步骤，Chloroquine 抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy 不能完成，所以 lc3 才会累积。 因此加了抑制剂 lc3 之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的 pH 值，使溶酶体中的酸性 水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的 LC3 不能按时降解，表现为 LC3 荧光长时间的保留或 WB 中 LC3 条带变粗。 Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制 EV71 感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。 研究发现，抑制细胞凋亡能增加 LC3-I 转化为 LC3-II 以及 p62 的降解。 1.  雷帕霉素：作为以 mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为 1μmol-10μmol； 2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合 从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol- 正常 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道 的药物有： 50umol。 自噬诱导剂 Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激 Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即 Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶） Earles 平衡盐溶液：制造饥饿 N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway 抑制剂 Rapamycin：mTOR 抑制剂 Xestospongin B/C：IP3R 阻滞剂 自噬抑制剂 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂 Bafilomycin A1：质子泵抑制剂 Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂） 衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于 DMSO 中配成储存液,使用时 D