软琼脂克隆形成实验.docVIP

软琼脂克隆形成实验原理及步骤 原理：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞的增殖能力。单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够和对照比较即有意义。 步骤： 1、配制100ml的1.2%?Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST? REGULAR?Argrose?G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。? 实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。? 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%?Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。? 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。? 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔板，配5ml上述培养液+5ml?1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。? 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。? 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%?Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS+2ml0.7%Argrose）上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔板中，每孔1ml。一般每个实验组重复3个样本，待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3周。? 8、间隔2天补加200ul?10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。? 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。?? 10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数×960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。 11.统计学分析：根据集落数和克隆形成率进行t检验，分析不同组别之间的差异。 注意：1）软琼脂克隆的操作相对复杂，在实验过程中一定要注意无菌操作。 ???2）在将琼脂于培养基混匀时，要注意琼脂温度，而且动作要迅速，避免局部结块。 ??3）制备好底层琼脂后，要待其完全凝固后再浇上上层琼脂。 通常下层1.2% Argrose快些铺，略有不平是没有太大关系的，上层0.7% Argrose与细胞混合时水浴不大于40度，小心均匀的铺，37度不会那么快凝固，孵箱里过几天就好了。 软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于不贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大，接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。?