淀粉中还原糖的测定.pptxVIP

实验目的 1. 掌握还原糖和总糖测定的基本原理。 2. 学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 实验原理 还原糖是具有还原性的糖类的统称。分子中含有游离醛基或者酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。如葡糖糖、果糖、半乳糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖等。 在碱性条件下，还原糖与 3 ， 5 一二硝基水杨酸共热， 3 ， 5 一二硝基水杨酸被还原为 3-氨基 -5- 硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系， 540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 仪器、试剂、材料 仪器 ： （ 1 ）试管X 11 （ 2 ）玻璃漏斗 X2 （ 3 ）烧杯： 1OOml X 1 （ 4 ）三角瓶： 100m1 X 1 （ 5 ）容量瓶： 100ml X 3 （ 6）恒温水浴 （ 7）沸水浴 （ 8）电子天平 （ 9）分光光度计 试剂 ： （ 1 ） 1 mg/ ml 葡萄糖标准液：准确称取 10mg 分析纯葡萄糖（预先在 8 0 ℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 10ml 的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 （ 2 ） 3 ， 5- 二硝基水杨酸试剂：将 0.315g 3, 5- 硝基水杨酸和 13.1ml 2mol/NaOH溶液，加到 25ml 含有 9.25g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 0.25g 结晶酚和 0.25g 亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 50ml ，贮于棕色瓶中备用。 材料 ： 食用面粉。 注意事项 1. 沸水浴时应将试管口用保鲜膜封住，以防止水分蒸发引起体积误差。 2. 应该待反应体系稳定后进行比色（约10min）。 3. 比色时，比色皿中盛放的溶液体积不应过多，一般在2/3~3/4。 4. 比色时不能将溶液溅在仪器面板和仪器内。 5. 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。 6.实验完成后洗净仪器，放回原位。 实验步骤 1.标准曲线的绘制 管号 1mg/ml葡萄糖标准液(ml) 蒸馏水 (ml) DNS (ml) 葡萄糖含量（mg) 光密度值 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 实验步骤 按照上表取7支试管配好试剂，将各管摇匀，在沸水浴中加热 5min ，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至 25ml ，混匀。在 540nm 波长下，用 0 号管调零，分别读取 1-6 号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 实验步骤 得出吸光值 管号 1mg/ml葡萄糖标准液(ml) 蒸馏水 (ml) DNS (ml) 葡萄糖含量（mg) 光密度值 0 0 2 1.5 0 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 0.052 2 0.4 1.6 1.5 0.4 0.196 3 0.6 1.4 1.5 0.6 0.293 4 0.8 1.2 1.5 0.8 0.441 5 1.0 1.0 1.5 1.0 0.549 6 1.2 0.8 1.5 1.2 0.668 实验步骤 以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线 实验步骤 2. 样品中还原糖和总糖含量的测定  样品中还原糖的提取：准确称取 3.0g 食用面粉，放在 50ml 三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加 25ml 蒸馏水，搅匀，置于 5 0 ℃恒温水浴中保温 20min ，使还原糖浸出。离心，用 2Oml 蒸馏水洗残渣，再过滤，将两次的滤液全部收集在 50ml 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 实验步骤 3 ）显色和比色，取 2 支 25 ml 刻度试管，编号，按下表所示的量操作。 管号 还原糖待测液（ml) 蒸馏水 （ml) DNS (ml) 光密度值 查曲线葡萄糖含量 (mg) 样品1 0.5 1.5 1.5 0.112 0.27 样品2 0.5 1.5 1.5 0.121 0.28 根据函数 y=0.595x-0.046 可得葡萄糖含量 样品光密度平均值=(0.112+0.121)/2=0.1165 实验结果及数据处理 已知提取液总体积为100ml、测定时取用体积为0.5ml、样品毫克数为3000mg、根据以下公式进行计算。 样品平均葡萄糖=0.27+0.28=0.275mg