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[生物]siRNAs在基因治疗中的应用 siRNAs在基因治疗中的应用 　　引言：小干扰RNAs(smallinterferingRNAs，siRNAs)是RNA干扰(RNAinterference，RNAi)过程中的效应分子.Fireetal[1]在1998年向秀丽隐杆线虫中注射双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子后降解了细胞质中含有同源序列的靶mRNA.随后的研究表明，RNAi现象广泛存在于真菌、拟南芥、斑马鱼、果蝇、小鼠及大鼠等大多数真核生物中.早期在哺乳动物细胞中应用长dsRNA可引起非特异性干扰素反应而导致细胞死亡，后来遗传学和生物化学研究证明将dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNAs后不引起干扰素反应，并能有效降解含有同源序列的靶mRNA.因此，siRNAs正迅速发展成为研究基因功能的新工具和作为治疗的新手段. 　　1、siRNAs的沉默机制 　　siRNAs是由RNase-III家族中被称为Dicer的核酸内切酶在细胞质中剪切自然存在的长dsRNA的过程中产生的.Dicer将长dsRNA剪切为21-28个核苷酸的siRNA双链.这种siRNA双链除了在5’末端是磷酸，3’末端是羟基外，3’端还有由2个核苷酸构成的悬突.siRNA双链与诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)结合后裂解为siRNA单链，与siRNA单链完全互补结合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，从而达到基因沉默的目的.现在siRNA能够像核酶一样通过化学合成的方法或者通过载体表达双链短发夹样RNA(shorthairpin-likeRNA，shRNA)进入到细胞内，后者在细胞内可转化为siRNA而发挥基因沉默效应.一些研究证明siRNAs还有其他沉默机制，例如在几种生物中能够通过RNAi途径修饰细胞染色质导致转录水平的基因沉默[2-3].  　　3、siRNAs的表达载体 　　由于siRNAs既可以通过化学合成获得，也可以通过载体表达，这使具有靶向性的药物应用于基因治疗成为可能.表达siRNAs的载体通常含有RNA聚合酶III启动子(RNApolymeraseIIIpromoter，polIII)或RNA聚合酶II启动子(polII)序列，首先转录生成与miRNA前体相似的shRNA，然后在细胞内变成siRNA发挥基因沉默效应.在活体内和培养组织细胞中应用表达siRNA的载体能够长时间整合到基因组中并“敲除”内源性基因.许多研究证明腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associatedviral，AAV)载体、逆转录病毒载体及慢病毒载体都能有效转染到活体内和培养细胞中.Shinagawaetal[10]研究表明含polII的表达载体能在体内产生由数百个碱基对构成的shRNA，而不诱导非特异性干扰素反应，这为siRNAs应用于哺乳动物提供了一种安全的新方法. 　　4、siRNAs在活体中的应用 　　通过电穿孔、局部注射或静脉注射的方法已经能够成功地将化学合成的siRNAs、表达siRNAs的质粒以及表达siRNAs的病毒导入到哺乳动物细胞中.但很难评价哪种方法能更有效的引起基因沉默.经鼠尾静脉高压注射溶于生理盐水的siRNA已经成功地将siRNA导入大鼠组织中，其中在肝中靶基因的沉默效率达90%以上，而在肺、肾、脾、胰中靶基因的沉默效率稍低[11-12].采用这种方法引起的基因沉默效应一般持续数天，在有些情况下可超过1wk，并且基因沉默的效率因物种的差异而不同. 　　表达siRNAs的病毒载体为研究哺乳动物的基因功能提供了新方法，更为治疗人类主要疾病带来了新希望.已经有几种病毒被设计用于表达siRNAs.重组AAV能在哺乳动物分裂期细胞和静止期细胞中长期表达siRNA.他们通常以附加体的形式随机、低频整合到宿主基因组中.有研究[13]表明向大鼠脑内注射表达siRNA的AAV载体能引起长达7wk之久的基因沉默效应.在HIV感染的组织模型中表达siRNA病毒载体也被成功地应用于治疗[14]. 　　现在又有几种新的方法将siRNAs导入活体内.最近有研究[15]表明大分子能够促进几种小分子物质经皮吸收，包括siRNAs分子.这将有利于siRNAs经皮吸收进入全身血液循环发挥治疗性药物的作用.将含siRNAs的气溶胶导入肺内也能起到基因治疗的作用[16]. 　　5、以siRNAs为基础的基因治疗 　　虽然siRNA在哺乳动物细胞中的应用仅仅4a，但他正以飞快地速度发展成为基因治疗的一种新方法.如果siRNAs通过尾静脉高压注射能有效到达肝脏，那么他将可以广泛应用于治疗各种肝病.