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安徽桑树品种全基因组DNA提取方法研究 0 引言中国是蚕桑生产的发源地，拥有极其丰富的桑树种质资源。随着分子生物学技术的快速发展，从分子水平上对桑树种质资源的遗传变异进行研究已成为桑树分子生物学研究热点之一。向仲怀等[1]运用RAPD技术构建了桑属9 个种的DNA指纹图谱，对桑属的植物分类进行了开创性的研究，开辟了中国分子标记技术研究桑树种质的先例。基因组DNA的提取是进行分子标记技术研究的关键步骤之一，高质量基因组DNA的获取是进行桑树生物学方面研究的基础。由于桑树是多年生木本植物，组织细胞含有大量的多糖、多酚、酯类等复杂次生代谢产物，因而要从中提取高质量的DNA有较大困难[2-5]。本实验采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法对安徽特色桑树品种的嫩叶进行DNA的提取，在实验过程中，优化了DNA提取程序，获得了高得率、高纯度的DNA，能成功地应用于后续的分子生物学反应。旨在为桑树基因组DNA的研究提供理论与技术参考，也为进一步深入开展其亲缘关系分析、基因组比较、遗传多样性分析等分子生物学研究提供一定的基础资料。1 材料与方法1.1 实验材料选取5 种安徽桑树地方品种（样本采自安徽省农业科学院蚕桑研究所桑树品种选育中心）。以桑嫩叶为实验材料，品种分别为：lsquo;金寨九龙桑rsquo;、lsquo;皖桑1 号rsquo;、lsquo;红星5号rsquo;、lsquo;皖花桑rsquo;、lsquo;7707rsquo;。1.2 DNA提取方法桑树基因组DNA提取采用CTAB法，参照赵卫国[2]的方法，稍加改进。①取0.1~0.2 g 嫩叶剪碎，在液氮条件下磨碎成粉末，转入经55℃预热的600 mu;L 的CTAB 提取缓冲液（0.1 mol/LTrisHCl，pH 8.0，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/LNaCl，2% CTAB，1% PVP，0.04 mol/L beta;-巯基乙醇）中；②混匀后在65℃水浴裂解30min，期间轻摇数次以混匀，室温冷却，12000 r/min 离心15 min；③加入500 mu;L氯仿:异戊醇(24:1)，抽提细胞残渣和叶绿体，轻轻颠倒混匀至乳白色；常温13000 r/min离心10 min；④转移上清液到新离心管中，加入等体积的预冷的异丙醇混匀，室温静置3~5 min；⑤常温下，10000 r/min 高速离心5 min，弃上清后倒置干燥，加500 mu;L ddH2O溶解；加入2 mu;L RNase(10mg/mL)，37℃水浴1 h；⑥加等体积酚抽提1 次，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1 次，氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次；⑦加2倍体积无水乙醇沉淀DNA，轻轻混匀，-20℃过夜；⑧13000 r/min离心10 min，弃上清，用70%无水乙醇洗涤DNA2次，每次8000 r/min离心10 min；倒置干燥后加入200 mu;L 的TE 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0)溶解DNA，样品保存于4℃或-20℃。1.3 DNA质量检测方法1.3.1 D(lambda;)法DNA完全溶解后，吸取5 mu;L DNA溶液，加95 mu;L TE，稀释100 倍后，在DU-70 紫外分光光度计上测定OD260和OD280值。1.3.2 电泳分析取DNA样品3 mu;L 与1 mu;L 6Loadingbuffer混匀，在1%琼脂糖凝胶（含EB）上电泳检测DNA质量，反应混合物在1TAE缓冲液中120V电泳30 min。电泳结果在Tanon(Gis-2008)凝胶成像系统拍照。1.3.3 PCR 分析参照文献[6] 设计扩增引物ITS5(5amp;acute;-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3amp;acute;) 和ITS4(5amp;acute;-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3amp;acute;)。PCR 反应体系总体积25 mu;L：2*Master Mix 12.5 mu;L；模板DNA 1.0 mu;L；引物各1.0 mu;L（ 浓度为10 ng/mu;L）；ddH2O 11.5 mu;L。PCR扩增程序如下：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35 个循环；72℃延伸5 min；PCR产物于4℃保存。2 结果与分析2.1 DNA样品纯度及得率5 种样品A260/A280比值均在1.80~1.90 之间。说明以桑嫩叶为材料所提取的5 种DNA样品中蛋白质、植物色素、多糖和酚类物含量较低，DNA的得率和纯度均较高，能够满足进一步分子生物学操作的需要。2.2 DNA样品的电泳琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取