变温对仿刺参Apostich,opusjaPonicus免疫力及抗病力的影响.docxVIP

变温对仿刺参Apostich,opusjaPonicus免疫力及抗病力的影响 摘要：水温一直以来被认为是影响仿刺参(Apostichopus japonicus)各项免疫指标的重要环境因素。为了探讨其对于仿刺参免疫力及抗病力的影响，首先对仿刺参进行了两组温度突变试验，分别为A组（11 ℃rarr;4 ℃rarr;11 ℃rarr;4 ℃rarr;11 ℃rarr;4 ℃）和B组(18 ℃rarr;11 ℃rarr;4 ℃)，取体壁、触手、体腔液、内脏四个不同组织，测定抗菌活力、超氧化物歧化酶(SOD) 、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)四个免疫指标。随后取B组温度突变的条件，进行攻毒感染试验，计算发病率和死亡率。结果表明：(1)在A组温度突变试验中，各项免疫酶指标一般在前两轮的温度突变中，差异不显著(P＜0.05)，而到了第三轮的温度突变时，体壁和触手中免疫相关酶活性显著上升(P＜0.05)。(2)在B组温度突变试验中,刺参机体的免疫及其相关酶在最适生长温度18 ℃下的活性较高，温度突降至11 ℃其活性下降，再降至4 ℃后有所回升，但仍低于18 ℃下的免疫活性；触手和体壁中免疫酶活性变化显著(P＜0.05)，而体腔液和内脏中免疫酶的活性变化不显著(P＜0.05)。(3)攻毒试验结果显示，温度突变各组刺参发病（吐肠及化皮率）及死亡率明显高于正常组。由此表明，温度突变作为一种环境胁迫，对于仿刺参的免疫力和抗病力产生重要的影响。体壁和触手作为刺参免疫屏障的第一道防线，对于环境变化最为敏感。关键词：仿刺参(Apostichopus japonicus)；变温；免疫力；抗病力仿刺参(Apostichopus japonicus)属于变温动物，自身免疫力受环境影响大。温度波动对刺参的生理活动及免疫反应均具有重要影响[1]。目前有关温度对仿刺参免疫力影响的研究，主要集中在降温对仿刺参生长及生理现象的研究等方面[2-4]。如低温使仿刺参耗氧量下降，出现负增长。不同群体仿刺参还出现排脏、皮肤溃烂(化皮)和死亡等现象。变温对刺参免疫力及抗病力的影响还未见报道。在本研究中，作者设计了两组温度突变实验，并取体壁、触手、体腔液、内脏四个不同组织，进行了抗菌活力、超氧化物歧化酶(SOD) 、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)四个免疫指标的测定。随后进行攻毒试验，统计发病率和死亡率。为深入并系统地研究环境因子对刺参免疫力及抗病力的影响提供了参考。目前认为，机体抗病力的下降是导致发病死亡的主要原因之一。本研究有助于深入了解刺参免疫防御特性，为刺参苗种的健康养殖提供了理论参考。1材料与方法1.1试验材料和条件实验所用幼参于2016年 3月6日取于大连黑石礁海域某海参养殖场,体长3～5 cm,平均体重2.60 g。取回后在60 cm25 cm40 cm玻璃水族箱内暂养,养殖用水为盐度29permil;～32permil;、pH 7.9～8.3、温度17～19 ℃的大连黑石礁海域过滤海水。暂养期间进行不间断充气、每日投饲、换水等日常管理，经暂养一周无异常现象，作为试验材料。1.2试验方法1.2.1试验分组设计了两组温度突变组，每24 h温度突变一次，每组6头幼参，设置3个平行组。A组： 11 ℃rarr;4 ℃rarr;11 ℃rarr;4 ℃rarr;11 ℃rarr;4 ℃，由起始温度11 ℃经24 h后，将幼参直接转到4 ℃下，共反复3次。B组：18 ℃rarr;11 ℃rarr;4 ℃，由起始温度18 ℃经24 h后，将幼参直接转到11 ℃，再经24 h转到4 ℃下。控温：将盛有2 L过滤海水的聚乙烯烧杯放入已调好温度的可控温生化培养箱中，24 h后，小心地把幼参移到下一个调节好温度的烧杯中。取样：分别在每次温度突变后的第1 h、12 h、24 h时每组随机取幼参1头，最后取3个样品平均值。1.2.2样品的制备在冰盘上解剖取触手、体壁、内脏、体腔液,装入样品袋中,-80 ℃深冷冰箱中保存，备用。触手、体壁、内脏分别称重后，按1∶10（w/v）加入冷PBS缓冲液进行匀浆，匀浆液移入1.5 mL离心管，离心。触手、体壁在4 ℃、6 500 r/min 离心20 min，取上清，-80 ℃冷冻保存，备用；肠、体腔液在4 ℃、7 500 r/min 离心20 min，取上清，-80 ℃冷冻保存，备用。1.2.3免疫酶的测定抗菌活力：采用Hultmaik等[5]方法在96孔酶标仪中进行。超氧化物歧化酶(SOD)活力：采用南京建成生物医药公司的试剂盒测定。碱性磷酸酶（AKP）：采用磷酸苯二钠法[6-7]。以每100 mu;L样品上清液在37 ℃与底物作用15 min，产生1 mg酚定义为一个酶活力单位。酸性磷酸酶（ACP）：采用磷酸苯二钠法[6-7]