Cu2+对鲫鱼过氧化物同工酶表达的影响.docxVIP

Cu2+对鲫鱼过氧化物同工酶表达的影响 对于生物而言，毒物与毒性是两个不同而又相关的概念，表现出毒性的物质，不能统统称为毒物，毒物也只在一定浓度、一定接触时间后才显出毒性，有的甚至还是生物不可缺少的微量元素，铜就是这种情况[1]。铜离子（Cu2+）在浓度较低时可提高抗氧化酶的活性；而在浓度较高时，会降低抗氧化酶的活性，从而使Cu2+变成一种抑制剂或有毒制剂[1]，因此，研究、探讨Cu2+对水生动物的影响十分必要。Cu2+被鱼体吸收后，一部分通过血液循环到达各组织器官，可能影响鲫鱼各组织内的过氧化物同工酶的活性，过氧化物同工酶（POD）是细胞中的一组重要的抗氧化酶，它们存在于细胞的过氧化物酶体内，以铁卟啉为辅基，可催化活性氧中的过氧化氢氧化[1]。同工酶是基因表达后分子水平的表型，测定同工酶谱是了解基因存在和表达的重要工具。本研究以鲫鱼作为研究对象，通过聚丙烯凝胶垂直平板电泳法来观察过氧化物同工酶的表型，采用生态学单因子梯度实验方法，对鲫鱼的过氧化物酶的表型进行观察研究。以期探讨Cu2+对鱼类的毒害机制以及与水体中的Cu2+浓度的相关性。1材料与试剂1.1实验鱼鲫鱼：健康，体表无损伤，体型匀称，体长8～10 cm。将购买回来的鲫鱼放在之前准备的、曝晒之后的自来水中预饲养，并投喂一定的鱼食，一天后染毒。1.2实验试剂及其配制硫酸铜（分析纯）：使用前先配成10 g/L的母液，使用时稀释成所需要的浓度。分离胶缓冲溶液（pH 8.9）：取48 mL 1 mol/L HCl，Tris36.8 g，用蒸馏水溶解后定容至100 mL。浓缩胶缓冲溶液（pH 6.7）：取48 mL 1 mol/L HCl，Tris5.96 g，用蒸馏水溶解后定容至100 mL。凝胶贮备液：丙烯酰胺 58 g，双丙烯酰胺 2 g，加蒸馏水溶解，定容至200 mL。存放于4 ℃棕色瓶避光保存。10%过硫酸铵溶液：1 g过硫酸铵溶于10 mL蒸馏水中（现用现配）。电极缓冲液pH 8.3：Tris 6 g，甘氨酸28.8 g用蒸馏水定容至1 000 mL。用时稀释10倍。上样缓冲液：浓缩胶缓冲液10 mL，甘油（丙三醇）5 g，1%溴酚兰1 mL。7%冰乙酸：取7 mL冰乙酸加水至100 mL容量瓶中定容。染色剂：联苯胺0.1 g+无水乙醇15 mL（提前配好）、15 mol/L乙酸钠10 mL、1.5 mol/L冰乙酸10 mL、蒸馏水75 mL混匀。PBS缓冲液pH 7.0： 取母液①32 mL和母液②68 mL混合即可。母液的配制：①0.2M Na2HPO4：称取 71.6 g Na2HPO4-12H2O，溶于 1 000 mL 水② 0.2M NaH2PO4：称取 31.2 g NaH2PO4-2H2O，溶于1000 mL 水1.3主要实验器材台式冷冻离心机、电子天平、HHS-2S型电热恒温水浴锅、DYCZ-24D 双垂直电泳仪、FD201 稳压稳流电泳、电子称、分析天平、托盘天平、移液枪（5 mL、1 mL、200 mu;L）、增氧泵、微量加样器2实验方法2.1鲫鱼的染毒实验将实验鱼在实验室暂养4 d后，挑选体格键壮，规格一致的鲫鱼进行染毒实验。实验在塑料水族箱中进行，实验用水为曝气24 h以上的自来水，每个水族箱中加入 40 L 含有 不同浓度Cu2+的溶液。实验分 4 个浓度处理组，Cu2+浓度分别为0.000 mg/L、0.008 mg/L、0.016 mg/L、0.032 mg/L，并配有平行组。每一水族箱中放实验鱼20尾，实验时水温保持在15～20 ℃，实验期间停止喂食，并用充气泵连续不断的充气。2.2粗酶液的制备Cu2+处理3 d后，从每个处理组中随机抽取健康鲫鱼 3尾，在冰盘内迅速解剖，分别取鳃和肝胰脏，用吸水纸吸去组织液后称重，并按 1∶1（W/V）比例加入预冷的提取液（0.1 mol/L pH 7.0 PBS），分别于冰浴中研磨成匀浆。匀浆后经 12 000 r/min，4 ℃条件下离心 20 min 制成粗酶液，于-20 ℃条件下保存。2.3电泳待测酶液的制备电泳前，将已制备好的各组粗酶液与电泳上样缓冲液按 1∶1（V/V）混匀，后直接进行电泳。2.4过氧化物同工酶电泳实验2.4.1电泳方法POD同工酶电泳采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）垂直平板电泳，7%分离胶（pH8.9） 和 3%浓缩胶（pH 6.7），电极缓冲液为Tris- Gly（pH 8.3）。用50mu;L的微量进样器点样量，点样量 20 mu;L/孔。电泳开始时电流恒定在每块板10 mA，当溴酚兰指示剂完全进入分离胶时，电流改为每块板20 mA，当溴酚兰指示剂电泳至凝胶底端大约0.5 cm时，停止电泳，小心地将凝胶片分离，以备染色。电泳过程约5 h。电泳水环境温度为 4