ELISA-双抗夹心法检测抗原解析培训讲学.pptVIP

改良双抗夹心法 双抗体夹心法检测可溶性抗原 双抗夹心法 优点： 待测抗原需要≥2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上； 由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物就可以建立此法； 重复性较好； 缺点： 操作复杂，费时费力 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法（BA-ELISA法） 间接包被 放大终末反应 BA-ELISA原理 BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B，biotin)与亲和素(A，avidin)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。 生物素是动植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H； 亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，对生物素有非常高的亲和力；（链酶亲和素是从链霉菌中提取，对载体吸附性比前者低） 亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂； 结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。 实验材料 小鼠INF-γ检测试剂盒的组成： Capture Ab：purified anti-mouse IFN-γ Detection Ab ：biotin-conjugate-anti-mouse IFN-γ Avidin-conjugate-HRP Standard：recombinant mouse IFN-γ （定量测定） Coating buffer 5×Assay diluent TMB solution 待测样品---- 经ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清 ELISA 操作要点 样品的保存 试剂的准备 固相载体 包被 加样 孵育(温育） 洗涤 显色和比色 样本的制备与保存： 血清样品和细胞培养上清：5天内测定，可以放置于4℃，超过一周，-80℃保存； ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清： 分别于活化后不同时间点收集培养的细胞，2000rpm，4℃离心分离上清，冰上放置，分装 试剂的准备 ELISA 中用的蒸馏水或者去离子水，包括用于配置coating buffer，稀释Assay buffer，洗涤的，应为新鲜的和高质量的； 从冰箱中取出的试剂应该平衡至室温后使用； 试剂最好现配先用 固相载体 最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性能； 国际上标准的是微量滴定板8×12的96孔板式； 已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-8℃）干燥的条件下一般可以保存6个月。 包被 定义：将抗原或者抗体固定在固相载体的过程称为包被； 物理吸附：两者的疏水基团通过疏水键的作用 抗体或者蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液（即本次实验用的coating buffer） 4-8℃包被过夜(有利于蛋白活性的保持），与37℃孵育2小时被认为具有相等的包被效果 包被的最适当浓度随着载体和包被物的性质和酶结合物的浓度调定 封闭 定义：继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程； 目的：抗原或抗体包被时所用的浓度比较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量的不相关蛋白质填充这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附； 常用封闭液：2%牛血清白蛋白，10%NBS+5%羊血清，5%脱脂奶粉； 本实验用封闭液：1×Assay buffer。 加样 ELISA中一般有3次加样步骤，即，加样本（和/或标准品），加酶结合物，加底物； 加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以溅出,不可以产生气泡； 多道加液器的使用 孵育(温育） 在ELISA中抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温的过程称为孵育； 常用温度：43℃，37℃，室温，4℃等 孵育时为了避免蒸发，可以用塑料封口胶或者保鲜膜封板 洗涤 洗涤在ELISA中虽然不是一个反应步骤，但决定了实验的成败 聚苯乙烯等塑料对蛋白的吸附是普遍的，洗涤可以清除在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质 洗涤可以清除残留在板孔中没有能够与固相抗原或者抗体结合的物质 常加入非离子表面活性剂（含有疏水基团+亲水基团），以抑制蛋白质吸附于塑料表面，如吐温20，0.05%的