菌种鉴定标准操作规程.docxVIP

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 菌种鉴定标准操作规程 目的： 建立菌种鉴定标准操作规程 范围： 适用于******鉴定标准操作 职责： 内容： 1 整体操作步骤 1.1 纯化、分离待鉴定菌 用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上 （如 TSA），划线分离， 以出现微生物单菌落为止。 1.2 挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。 1.3 如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则 选用 API20NE 试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实 验后选用 API20E 试剂条进行鉴定。 1.4 如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则 选用 API Strep 试剂条进行鉴定， 如实验结果为阳性则选用 API Staph 试剂条进行鉴定。 1.5 假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞， 则选用 API 50CHB 试剂条进行 鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用 API Coryne 或其他试剂条进 行鉴定。 1.6 选定正确的试剂条以后，根据不同的 API 试剂条的标准操作规程准备接种物， 进行接种、 培养等操作并将结果形成数码， 用 API 鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均 可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。 2 革兰氏染色 2.1 染色剂的配制 2.1.1 结晶紫染色液： 甲液：结晶紫 1.0g 95%的酒精 20ml 乙液：草酸铵 0.8g 水 80ml 将甲液和乙液混合均匀，静置 48h 使用，置密闭棕色瓶中储存。 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2.1.2 碘液： 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 水 300ml 配制时先用 3～5ml 水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再 加水稀释至 300ml ，摇匀，分装在棕色瓶中储存。 2.1.3 稀石碳酸红溶液 : 碱性品红 1.0g 石碳酸 5.0ml 95%乙醇 10.0ml 配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至 100ml ，摇 匀。 2.2 操作: 2.2.1 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则 先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。 2.2.2 干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干， 并在火焰上通过 2～ 3 次，以固定涂片。 2.2.3 染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本， 染色 1 分钟。 2.2.4 水洗：斜置玻片使很细水流的纯化水从染色标本的上端流下，勿使水流直接 冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止。 2.2.5 滴加碘液冲去残水并媒染约 1 分钟，用纯化水冲去碘液吸干。 2.2.6 滴加 95%的乙醇脱色约 20～30 秒，脱色时应将玻片微振动，使酒精分布均 匀，立即用水冲净。 2.2.7 稀石碳酸红溶液染色 1 分钟后，用水洗净晾干或吸干。 2.2.8 镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用 100 倍物镜观察细菌革兰氏属性。 革兰氏阳性菌染色成蓝紫色， 革兰氏阴性菌染成红色， 同时做阳性对照。 3 简单染色 3.1 用于真菌与细菌的鉴别。 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3.2 操作: 3.2.1 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层， 固体培养物则 先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。 3.2.2 干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干， 并在火焰上通过 2～ 3 次，以固定涂片。 3.2.3 染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本， 染色 1 分钟。 3.2.4 水洗：斜置玻片使很细水流的自来水从染色标本的上端流下，勿