6氨基移换反应及其产物的鉴定.docVIP

专业： 姓名： 专业： 姓名： 孙程珂 学号： 3150100531 日期： 地点： 装 订 线 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师：杨劲树 成绩： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理； 2、学习纸层析的原理和操作技术。 二、实验内容和原理 1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性较高。 GPT催化下的转氨基反应为： L－谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L－谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L－谷氨酸。 本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。 2. 纸层析原理： 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。 层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。 装 订 线P.2实验名称：_ __________________姓名： 学号： 装 订 线 P.2 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=X/Y 在一定的条件下某种物质的Rf?值是常数。Rf值的大小与样品的性质、结构、溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外，样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。 茚三酮的显色原理： 所呈现的颜色随反应的条件(酸度、温度、盐浓度、铜、镉离子等)不同而异，本实验中其颜色的深浅主要与谷氨酸/丙氨酸的浓度有关。 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料： 动物肝脏(牛蛙肝或猪肝） 2、实验试剂： ⑴ 0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）； ⑵ 0.1mol/Lα－丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）； ⑶ 0.1mol/Lα－酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）； ⑷ 0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）； ⑸ 展层溶剂－酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）； ⑹ 10％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）； ⑺ 0.25%碘乙酸（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性）； ⑻ 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。 实验仪器 ⑴ 研钵； ⑵ 试管及试管架； ⑶ 恒温水浴箱（37℃、100℃）； ⑷ 铅笔、尺和圆规； ⑸ 毛细管（直径0.5mm)； ⑹ 新华定性滤纸（直径11cm）； ⑺ 剪刀和镊子； ⑻ 电吹风； ⑼ 滴管； ⑽ 康氏皿； ⑾ 喷雾器。 四、实验方法和步骤 1、转氨酶液的制备 取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。 2、氨基移换反应 取4支洁净、干燥的试管，按表1操作 3、层析 ⑴ 准备： ①取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2 cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点