胰岛素基因的获取.docVIP

PAGE PAGE 1 胰岛素基因的获取 和表达实验 　 生物技术一班　 　 　 寻找高表达的靶器官,获取目的mRNA 胰脏是胰岛素的高表达器官。胰脏中有胰岛A细胞和胰岛B细胞，胰岛A细胞产生胰高血糖素，胰岛B细胞产生胰岛素。在胰脏中切除含胰岛B细胞较多的组织用于提取目的mRNA 总RNA的提取 总RNA的抽提方法有多种，Trizol试剂是使用组广泛的RNA抽提试剂，只要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质即核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA的纯化。 mRNA的纯化 该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA﹢的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。 3 . RNA甲醛变性胶电泳 提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。 设计引物 根据已知的编码胰岛素的核苷酸序列，设计引物，将目的mRNA筛选出来。 合成cDNA 用逆转录法以目的mRNA为模板，在逆转录酶催化下合成cDNA。 目的mRNA顺序是从NCBI中搜索得到的，数据如下： Homo sapiens insulin (INS) mRNA, partial cds /translation=WGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAED LQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN sig_peptide 1..25 /gene=INS misc_feature 26..115 /gene=INS /note=insulin B chain misc_feature 124..216 /gene=INS /note=C-peptide misc_feature 223..285 /gene=INS /note=insulin A chain ORIGIN 1 ctggggacct gacccagccg cagcctttgt gaaccaacac ctgtgcggct cacacctggt 61 ggaagctctc tacctagtgt gcggggaacg aggcttcttc tacacaccca agacccgccg 121 ggaggcagag gacctgcagg tggggcaggt ggagctgggc gggggccctg gtgcaggcag 181 cctgcagccc ttggccctgg aggggtccct gcagaagcgt ggcattgtgg aacaatgctg 241 taccagcatc tgctccctct accagctgga gaactactgc aacta 二、 PCR 将提取的目的mRNA，在逆转录酶催化下，合成cDNA,然后利用PCR技术获得大量目的基因。 三、 碱裂解法抽提质粒DNA 当目的基因片段10Kbp时用原核细胞质粒作载体，当目的基因片段23Kbp用真核细胞质粒作载体。 质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，能在宿主菌中自主复制，还能编码一些遗传性状，如抗药性，利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。 碱裂解法制备质粒DNA的原理是：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，细胞内含物从细胞中裂解出来，当加入中和液后质粒DNA分子能够迅速复性呈溶解状态，离心时留在上清中，细胞内含物呈絮状。 四、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂作支持介质的一种电泳方法。在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率取决于DNA分子本身的大小等，通过电泳条带分析提