高效液相色谱演示版.pptVIP

液相色谱仪（3） 演示课件 液相色谱仪（4） 演示课件 二、高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速、高沸点、 热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 演示课件 三、流程及主要部件 1.流程 演示课件 2.主要部件 (1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性 演示课件 (2)梯度淋洗装置 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 演示课件 (3) 进样装置 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示： 演示课件 (4) 液相色谱检测器 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 演示课件 b. 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。 演示课件 演示课件 光电二极管阵列检测器 演示课件 c. 示差折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种； 演示课件 示差折光检测器 演示课件 d. 荧光检测器（fluorescence detector） 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； 演示课件 (5) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 演示课件 有人形容，柱是HPLC的心脏，可见在HPLC工作中选择柱的重要性。因为用不同的柱，因其分离机理也不同，得到的效果也不同。通常有：反相HPLC，疏水HPLC，凝胶过滤HPLC，各种离子交换HPLC，亲和HPLC等等。 演示课件 对色谱工作者来讲，柱效是不离口的。新柱到货后，厂方都应有检查柱效的结果报告附上。用户可以据此检查验收，但由于试剂、水质、仪器型号等方面的差异和运输过程的影响，按常规，柱效允许有10％的差别。 演示课件 　　 柱的分辨力和柱效的测定，一般采用几种化合物为标淮，在特定的条件下进行分离，并据此结果计算柱效。 一、柱效的测定 演示课件 以Beckman公司的反相柱为例，采用一些小分子化合物，配置如下：Acetophenone (苯乙酮）33mg，Nitrobenzene（硝基苯） 59mg，Benzene（苯） 2g，To1uene （甲苯）3g，溶于3L甲醇中备用,进样5ul，254nm检测。 演示课件 在鉴定Phenyl 5PW柱时用丙酮为标准品，水作流动相;在鉴定CAA-HIC柱时用α- 胰蛋白酶原为标准品(5mg／m1，进样5u1)，3.0M (NH4)2SO4 ,0.5M NH4Ac(pH 6.0)和0.5M NH4Ac (pH 6.0)，20min内线性梯度洗脱； 演示课件 在鉴定DEAE-和CM-柱时，分别用Uric acid(0.1mg／m1)和Tryptamine(0.1mg／ml作标准品； 在鉴定G2000SW 或G3000SW时分别用Dextran (MW 500000)，PEG(MW 7500)和PEG(MW 3000)或已知分子量的蛋白质为标准。 此外还有Cyano-，IP-，Si