炭疽细菌学、血清学检查.pdfVIP

WS 283—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 炭疽细菌学检查 B.1 生物安全要求 应按照GB 19489和《人间传染的病原微生物名录》要求执行。 B.2 显微镜检查 所有来自患者或尸体的标本，都应首先立即涂片，革兰染色，进行显微镜检查。如发现大量两端平 齐的革兰阳性大杆菌，即可作为诊断依据。 B.3 细菌分离培养 B.3.1 标本处理 皮肤病灶标本、血液、脑脊液、鼻（咽）拭子、痰液、尸检标本、动物组织等标本直接涂布血平板 或营养琼脂平板，血液标本也可直接接种血培养瓶。环境标本、粪便及呕吐物标本，用两倍量蒸馏水或 生理盐水制成悬液，经自然沉淀除去粗大颗粒物后，所得的悬液取1 mL于65℃加热15 min～20 min后， 取100 µL～200 µL涂布平板。 B.3.2 挑选可疑菌落 上述平板在37℃孵育8 h～24 h后，检查是否长出可疑的炭疽芽胞杆菌菌落。炭疽芽胞杆菌菌落的 形态为：灰白色、不透明、圆形或不规则形状、表面呈毛玻璃样，低倍镜下菌落呈卷发状。血平板上不 溶血或微溶血。 B.4 炭疽芽胞杆菌鉴定 将上述可疑菌落挑出，划线接种于营养琼脂平板，在划线区内一处滴一滴诊断用炭疽噬菌体，另一 处贴一片青霉素药敏纸片。37℃孵育8 h～24 h后，在滴噬菌体处有透明噬菌斑，青霉素药敏纸片周围 有明显的抑菌环，便可判定接种物为炭疽芽胞杆菌。可疑菌落也可进行核酸检测，检出炭疽芽胞杆菌特 异性核酸片段可判定为炭疽芽胞杆菌（见附录D）。 6 WS 283—2020 附 录 C （规范性附录） 炭疽血清学检查 C.1 标本要求 需采集患者急性期和恢复期双份血清进行检测。急性期血清应在首次检视病人时采集，血清分离后 首先取少量进行一次抗体检测，其余置-20℃以下保存，待获得恢复期血清后，两份血清再一同进行抗 体检测。可采用酶联免疫吸附试验、免疫层析法或其他免疫学方法进行检测。 C.2 酶联免疫吸附试验（ELISA） C.2.1 试剂选择 可使用商品化试剂盒，按操作说明书进行操作，也可按以下步骤进行操作。 C.2.2 试剂准备 C.2.2.1 ELISA包被液 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4：称取8 g NaCl，0.2 g KCl，3.58 g Na HPO ·12HO， 2 4 2 0.3 g KH PO ·2HO，加双蒸水900 mL左右，用HCl/NaOH调节pH至7.4，最后定容至1 000 mL，15psi （1.05 2 4 2 2 kg/cm ）高压蒸汽灭菌。 C.2.2.2 洗涤液 吸取5 mL吐温-20加入995 mL 0.01 mol/L PBS中，混匀。 C.2.2.3 血清稀释液 取0.1 mol/L PBS 20 mL，加双蒸水160 mL，加脱脂奶粉10 g，加1 mL吐温-20，混匀，调节pH至7.4， 用双蒸水定容至200 mL。4℃保存，两周内使用。 C.2.2.4 ELISA稀释液 除吐温-20的含量为0.1%外，其他成分与使用要求同血清稀释液。 C.2.2.5 显色液 3,3,5,5-四甲基联苯胺 （TMB）溶液即用型。 C.2.2.6 显色终