汇总胶体金生产工艺配方原则.ppt

释放慢 您的释放垫是怎样封闭的? 是否加了亲水试剂？ 是否用了大量的蛋白? 是否用了大量的糖? 试纸条各组分之间接触紧密么? 释放垫再次湿润困难 您使用的是哪一种释放垫? 是亲水的么? 您是怎样封闭释放垫的? 三、和样品垫相关的配方和原理 作用：改变样本PH, 调节爬速, 控制金标释放，抑制非特异性吸附,降低背景 基本成分： 1）缓冲系统：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物缓冲液等。 2）表面活性剂：Tween-20，Tritonx-100等。 3）大分子聚合物质：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA 4）惰性蛋白：BSA 、OVA、Casein。 5）生物物质：鼠IGg，抗红细胞抗体等。 血清类样品垫 注意爬速，背景，灵敏度的达到和假阳的消除。 全血类样品垫 1）必须能够去除红细胞！ 2）还需具备下列功能 不能造成溶血 不能干扰样品 分离必须快速高效 必须能够分离一定范围内的不同血样量 灵敏度的达到和假阳的消除 尿液类样品垫 注意交叉反应的消除。 影响抗原抗体反应的外部因素 电解质 抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中须有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集，形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用O.85％氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。 酸碱度 蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质。抗原抗体反应一般在pH为6～9进行。 温度 抗原抗体反应必须在合适的温度中进行，一般以15～40℃为宜，最适反应温度为37℃。某些特殊的抗原抗体反应，对温度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。 反应时间 反应时间越长，抗原抗体反应越充分，显色也越深。 所有调整辅料的思路都可从抗原抗体反应的影响因素和辅料的成分性质进行考虑和设计。 四、相关问题 假阳问题 假阴问题 稳定性问题 上样问题 （一）假阳问题 未标记上的金颗粒（裸金） 电荷作用 疏水作用 硫醇类物质的存在（S-H键起作用） 抗原抗体作用（内源性物质） 抗凝剂和防腐剂的影响 其他原因 多位点结合 只有1个位点的结合是可逆的 多位点结合使得蛋白稳定在固相表面， 即使其中的每个单位点都是可逆的 影响蛋白结合的因素 蛋白缓冲液 使用的膜 蛋白自身 应用体系 蛋白缓冲液 没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别优化。 作用：提供适合的PH, 改善亲水性, 增溶性,提高稳定性 定律: “蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越强” 缓冲液的优化 离子强度 对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度，蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度，溶液配制中就已会出现沉淀。 pH 蛋白在等电点最不稳定 沉淀剂 通常用醇降低蛋白的稳定性，也可润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。 盐 通常不会影响 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 减少信号强度，消假阳 糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减缓老化速度，也可以增加亲水力。 惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 表面活性剂：增加亲水力，也可增色。 缓冲液的基本成分 各种缓冲系: Tris-HCl, PB, CB等 盐类：NaCl 糖：蔗糖，海藻糖等 表面活性剂：Tween20，Triton x-100等 惰性蛋白：Casein等 防腐剂 ：叠氮钠，卡松等 推荐的起始缓冲液 10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol “潜水艇” 效应 表面活性剂处理过的膜在使用时的常见问题 因为使用的表面活性剂是水溶性的 喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了 反应动力学 流速增加,反应速率减低 流速增加,检测时间缩短 流速增加,灵敏度降低 流速增加,试剂用量增加 流速增加,背景降低 距离增加,流速降低 孔径增加,蛋白结合量减少 二、和金子垫相关的配方和原理 和金子垫相关的工艺和配方有： 1）标记工艺； 2）金标稀释液 3）金垫处理液 标记工艺 胶体金：一般指金的水溶液，又称金溶胶。 ---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。 其中分散的金颗粒直径一般在1~100nm之间，为负电荷分布。 高质量结合物 单个分散的颗粒 圆形颗粒 很少聚集 这样得到的胶体稳定性 和重复性好 Cluster free, high quality gold