不同血液保存方法对rna提取的影响(简易版).docVIP

不同血液保存方法对 RNA提取的影响 一、引言 1.1 探索血液 RNA 保存方法的必要性 全血作为较易获取的人体标本，特别适用于实验室和临床检测。高质量的 RNA 可以满足 RT-PCR、qRT-PCR、Northern blot、基因表达谱、转录组测序、 核酸酶保护实验和阵列分析等生物学下游实验的研究需求[1]。但由于 RNA 自身 结构为单链状态，极不稳定，同时广泛分布的 RNase 时刻发挥着降解 RNA 的功 能，其活性难以被抑制，因此使得从全血中提取 RNA 以及对 RNA 的保存相对 困难。 1.2 常见的血液 RNA 保存方法 第一种为分离白膜层[2]，加入 RNAlater 保护剂冻存-80℃。此种方法为目前 样本库常用的血液 RNA 保存方法，采血后需在常温保存 4 小时内完成白膜层分 离，或在采血 2 小时内放入 4℃冰箱保存，24 小时内 4 ℃低温分离，将分离获得 的白膜层用 RNAlater 保护剂保存，RNAlater 的主要作用为提供高盐环境使细胞 脱水，抑制核酸酶活性。此种方法的优势在于可将全血中大部分对于提取 RNA 无用的成分去除，缩减了样本的体积，更加便于保存。但此种方法的弊端在于， 首先分离白膜层的过程较为繁琐，需要多次离心，在临床医院或临时的采血点往 往难以实施，其次高盐脱水后的细胞复性困难，提取 RNA 的难度增加，且高盐 组分不易去除，提取的 RNA 纯度不高，最后血液在分离白膜层过程中，会有部 分白细胞及 RNA 组分缺失。 第二种为专用的静脉真空采血管，其中添加了特殊的试剂，可以保护细胞内 的 RNA，防止降解，但此方法核酸得率偏低，需大量血液来支撑下游实验研究。 本实验内容纵向地比较了两种血液保存方式下，RNA 保存效果的对比；并 探索了在不同保存温度及不同保存时间下，RNA 的保存效果。希望本文可为广 大的科研同胞们提供帮助。 二、材料和方法 2.1 标本来源 本组血液样品均采自同一志愿者，采用标准静脉穿刺技术，一次性使用真空 采血管 EDTA·Na2 5 ml（购于江苏康捷医疗器械有限公司）采集静脉血，全部标 本白细胞计数范围为 3.16×103~3.25×103。 2.2 方法 2.2.1 白膜层分离 采集 3 管新鲜血液，每管 5ml，采血后 10 min 内 3,000 rpm 离心 10min，吸 弃血浆，加入和血浆等体积的 PBS 缓冲液，颠倒混匀。取 15 ml 离心管，加入 7.5 ml Ficoll-paqueTM PLUS lymphocyte isolation sterile solution（购于 GE 公司， Lot，吸取采血管中血细胞加入分离液中分层，2,000 rpm 离心 20min。 吸弃上层 PBS，移液器吸取白膜层转移至 5 ml 离心管中，加入 PBS 吹打混匀， 2,000 rpm 离心 10min，弃上清。加入 400 ?l PBS 缓冲液重悬，然后分别缓慢加 入不同 RNA 保护液。 Q 组：加入 1.2 ml RNAlater RNA Stabilization Reagent （购于 Qi***n 公司， Lot.15****995）； A 组：加入 1.2 ml A***on RNAlater Solution （购于英**基，Lot.00****70）； B 组：加入 1.2 ml RNAfixer 保存液（购于 Bioteke 公司，Cat. RP1302）。 将三管样品均冻存于-80℃保存。 2.2.2 白膜层 RNA 提取（沉淀法） 取 200 ?l 保存的白膜层，加 2 ml RL 裂解液，涡旋混匀 30 s，室温裂解 15min； 加入 300 ?l 氯仿，涡旋混匀 10s，室温放置 3 min；12,000 rpm 离心 10min，吸 取水相，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀至少 2h，若出现浑浊，加入 DEPC 水配 制的 50%异丙醇，直至混浊消失；4℃，12,000 rpm 离心 15min，小心弃上清； 加入 1 ml 75%乙醇漂洗 2 次；30 ?l RNase-free H2O 溶解。 2.2.3 白膜层 RNA 提取（离心柱法） 严格按照试剂盒操作说明操作，所用试剂盒为： 血液（液体样本）总 RNA 快速提取试剂盒（离心柱型）（购于 BioTeke， Cat.RP4001）； 动物组织总 RNA 提取试剂盒（离心柱型）（购于 Tiangen，Lot.P4920）。 2.2.4 血液 RNA 保存管提取 RNA 采集新鲜全血，30 min 内转移 2.5 ml 至 10 ml 血液 RNA 保存管（购于 BioTeke，Cat. ST1001）中，涡旋混匀 30s，室温放