生物大分子药物色谱表征入门指南.doc

安捷伦科技 生物大分子药物色谱表征入门指南 目录 生物大分子药物表征概述04 肽图分析指南08 糖谱分析20 亲和色谱测定抗体滴度28 体积排阻色谱分析蛋白质聚集体和降解产物36 采用反相色谱进行蛋白鉴定与杂质分析42 离子交换色谱表征蛋白质电荷异构体50 3 生物大分子药物表征概述 一、生物大分子药物表征与质量控制 过去，大多数药物都是化学合成的小分子。如今，随着越来越多的小分子药物专利过 期以及来自非专利仿制药物的强大竞争，特别是生物药物的靶向治疗优势日益凸显， 生物药物逐渐占据了重要的市场份额，并显现出巨大的增长潜力。生物药物可以是 RNA（如microRNA）、寡聚核苷酸、多肽或者蛋白质。凭借细胞特异的作用方式和相 对低的化合物特异毒性，这类药物取得了巨大的成功。其中蛋白治疗药物的发现和开 发正在快速增长，不久将会赶上甚至超过化学药物。在下面的讨论中，主要关注蛋白 类生物大分子药物。 小分子药物一般通过化学合成得到，其结构非常清楚，但是治疗用蛋白质药物的生产 和表征都很困难。这些蛋白质是从各种生物基质中分离得到，一般是由紧密相关的不 同分子量和不同电荷的异构体组成的不均一混合物。它们从活细胞中得到且往往包含 多种与产品和工艺相关的杂质。此外，重组蛋白还常常出现复杂的翻译后修饰，具有 部分依赖二硫键的高度特异的三维结构，并且可能发生聚集、吸附和截短。因此，全 面的化学、物理和构像表征对于了解重组蛋白药物的异质性、杂质谱和有效性是非常 必要的。准确的氨基酸序列、分子量、价态变化、糖基化、聚集水平以及氧化水平都 是蛋白质药物表征的关键要素。对于杂质，尤其是那些可能诱导发热反应或免疫反应 的化合物必须进行鉴定、表征并尽可能减少其在最终产品中的含量。为了减少氧化和 水解等化学变化导致的药物降解，延长药效持续时间，合适的剂型设计也非常重要。 因此，准确并且可重复的表征方法对于支持和指导药物生产以及制剂决策不可或缺。 和所有其他药品一样，生物药品的原料药和终产品也必须进行严格的质量控制。必须 对产品的成份、杂质、含量（如蛋白质含量）和稳定性进行检测，保证生物药品的安 全性和有效性。全面的质量控制也是所有GMP 法规的要求，是监管检查的重点。传 统小分子药品与生物药品表征和质量控制（QC）的最根本区别在于两者用于测定产品 特性（同一性、效价、纯度和杂质谱）的方法不同。这是因为两者的产品性质截然不 同。由于其高度的复杂性，生物技术产品的分析过程更为复杂。蛋白质分子的分子量 比传统药物大2～3个数量级。原料药来源于活体细胞，通常含有一系列复杂的产品和 工艺相关杂质。另外，蛋白质还经过复杂的翻译后修饰，有高特异性的三维或四维结 构，可能发生聚集和/或吸附作用。 4 尽管分析仪器已经有了很大的进步，仍然无法对所有生物技 体和其他浸出物）。产品相关杂质为氧化、异构化等修饰产生的 术药品进行完全的表征。因此，监管部门和生物制药行业没 杂质，以及脱酰胺基、聚合和截断等翻译后修饰产生的杂质。 有使用“完全表征的生物药物（Fully Characterized Biological Drugs）”这样的术语，而是代之以“良好表征的生物药品（Well Characterized Biological Drugs, WCBD）”。国际人用药注册技 术协调会议（ICH Q6B ，测试方法和接受标准:生物技术和生物 药品，SPECIFICATIONS: TEST PROCEDURES AND ACCEPTANCE CRITERIA FOR BIOTECHNOLOGICAL/ BIOLOGICAL PRODUCTS) 建 议通过理化性质、生物活性、免疫化学活性、纯度和含量来表征 产品。 表1是生物药品检验项目示例，从列出的检测方法可以看到，现 代仪器分析方法，包括液相色谱法、核磁共振法、质谱法等已经 逐渐成为生物大分子药物表征的不可或缺的手段，特别是在理化 参数以及含量与杂质检测方面具有不可替代的作用。 作为全球 领先的分析测量专业公司，安捷伦提供的测量工具可让您对于了 解生物分子在整个开发过程中的确切状态满怀信心。我们的解决 方案提供稳定可靠的分析方法，能确保对生物药物的透彻表征以 及向质量控制的顺利转移。在这本小手册中，我们专注于各种色 1、理化参数 理化参数包括一级结构、组成和理化性质的测定。一级结构的信 息可以结合肽图、C-端和N-端序列、氨基酸组成和序列等一系列 结果来确定。蛋白质的高级结构也很重要，因为它们对药品的活 谱分离模式在生物药物表征中的应用。如您需要有一个整体的了 解，请参考生物药物开发和 QA/QC 领域的安捷伦应用（5991- 1504CHCN）。 性有显著影响。高级结构的数据可以通过光谱方法获得，如圆二 色光谱（CD）