实验4-肝微粒体制备-20121108讲课.docVIP

实 验 五 肝微粒体制备及相关酶活性测定 肝脏损伤的检测与评价 评价化学毒物引起肝损害的方法有两大类： 1. 体内实验（in vivo test） 即整体动物试验 2. 体外实验（in vitro test） 1. 体内试验 方法是将肝毒物给予受试动物，然后 处死动物或在动物存活的情况下进行各种 生物检测，如动物染毒后的血清酶学分析、 肝脏排泄与分泌功能测定、肝脏化学组成 分析以及肝脏损害的组织病理学检查等。 2. 体外试验 是指采用某种实验技术从动物机体分 离出肝脏或肝细胞的亚细胞结构，让其 在 体外与肝毒物接触一定时间，然后进行各 种检测，如动物的离体肝灌流试验、肝细 胞原代培养与肝细胞毒性试验、肝匀浆毒 物代谢试验等。 一、本次实验的目的和原理 1.微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程 中获得的由破碎的内质网自我融合形成的 近似球形的膜囊泡状结构，包含内质网膜 和核糖体两种基本成分，在体外实验中具 有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成 等内质网的基本功能。 2.肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微 粒体能够在不同的离心速度之下，从其他 的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。 3.组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线 粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并 分离，而细胞色素P450、内质网碎片及 其他可溶性酶素则保留在上清中。 4.取上清在更快速的100,000g离心旋转之 下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状， 而可溶性酶素则保留在上清中，将沉淀重 悬即可得到微粒体。因此微粒体在细胞生 物学中定义为从内质网的碎片所得到的小 型囊泡 。 5.微粒体含有细胞色素P450，由于P450中的 辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常 呈现红褐色。 6.肝微粒体（hepatic microsome）富含多 种物质代谢酶类，在外来化学物的生物转 化中起着极其重要的作用。某些外来化合 物可通过诱导或抑制肝微粒体代谢酶的活 性，影响其他外来化学物在体内的代谢结 局。 二、实验仪器及药品 1. 器材 ： 电动匀浆机、漩涡混合器、高速冷冻离心机、 天平、解剖器械、烧杯、注射器、离心管 （15ml）、加样枪、枪头、滤纸等。 2. 试剂： 0.9%氯化钠溶液（每人50ml）； pH7.4的 蔗糖-Tris-盐酸缓冲液（每人5ml） ； pH7.4的氯 化钾-Tris-盐酸缓冲液；88mmol/L氯化钙溶 液； pH7.4的磷酸缓冲盐溶液。 3. 实验动物：成年小鼠 三、实验步骤 1. 处死小鼠； 2. 快速摘除肝脏，自门静脉注入预冷的冰生理盐水 20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，再用生理盐水将 肝脏外周血水冲洗干净，用滤纸擦干净后称重、 记录。 3. 将称重后的肝组织置于烧杯中（置冰板上）剪碎 ，转入匀浆管中，并按每克肝组织加1～2ml预冷 的蔗糖-Tris-盐缓冲液，用电动匀浆机制备匀浆 （转速1000rpm）（冰浴中）,研杵上下移动8－ 10次，定容至5ml。 4. 将匀浆液离心（4℃，1000g，10min） 5.取上清离心（12000g,10min）； 6.取上清计算体积，按10：1比例加入预冷氯 化钙，冰浴5min，摇匀，以25000g/min离 心15min,弃上清得粉红色微粒体沉淀 。 7.将微粒体沉淀混悬于氯化钾-Tris-盐酸缓 冲液中(2ml)，用漩涡混合器充分混匀； 8.离心25000g/min, 15min； 9.按1g肝组织加1ml磷酸缓冲盐溶液,充分混 匀后冻存管分装,置-80℃冰箱内保存待用. 注意事项： 上述过程应使用预冷的匀浆介质、缓冲液 和离心转头。匀浆器、容器等均应保持在冰 浴中，以维持组织及其制备物在0－4℃的 范围。 四、结果分析与讨论 Thanks!