十五艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法精品文档.pptVIP

耐药机制： 核苷和核苷类似物 1 、 破坏核苷类似物结合病毒 DNA 的能力 M184V 突变 : RT 酶第 184 位密码子 的氨基酸由蛋氨酸 (M) 变成为缬氨酸 (V) 。拉米夫定 (Lamivudine) Q151M mutation: 在 HIV-1 中出现低于 5% ； HIV-2 中出现频率较高。 耐药机制： 2 、 切除病毒 DNA 链末端的核苷类 似物 Thymidine analogues mutations: 突变引起 ATP 或者焦磷酸介导的切除 DNA 链 3‘ 末端核 苷类似物。 核苷和核苷类似物 耐药机制： 非核苷逆转录酶抑制剂 (NNRTI) 突变降低了抑制剂对酶的结合力。不同 于核苷逆转录酶抑制剂，其单一突变就 能导致高度耐药。如 K103N 、 Y181C 。 耐药机制： K103N 突变的机制 耐药机制： 蛋白酶抑制剂 HIV 蛋白酶由两个同样的蛋 白质链组成。这两个蛋白质链 在一起就如同核桃的两半，而 蛋白酶的活性位点就在两个半 壳的中间。 突变点的表示方法： 基因的突变通常以字母－数字－字母的书写方式 来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处 的氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了的 氨基酸，中间数字表示突变点的位置。例如：逆转录 酶（ RT ） K103N 的突变表示逆转录酶第 103 位密码子 的氨基酸由天冬酰胺（ K ）变成为赖氨酸（ N ）。 如何检测耐药株： 目前耐药性检测有两种方法，即 表型检测及基因型检测 。表型检 测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方 法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低，技术 也相对容易，可在样品收集后 1 ～ 2 周得到结果，但分析基因型耐药检 测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交 叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以直接检测病毒 的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前 国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。 如何检测耐药株： Translation into linear string of amino acids Folding into functional protein HIV RNA 表型检测 基因型检测 基因型和表型检测 检测中注意事项 : — 在病人仍在治疗失败的方案上收集样品，可保 证耐药株占总病毒量的 20% 以上； — 病毒载量 1000 时 , 可出现假阴性。 我国 HIV 耐药性本底抽样调查结果 1) 对于 RT 基因区共完成对 21 个省区共 143 个样本的测序， 仅有 2 例发现具有轻微耐药（占总样本数的 1.4% ） 2) 对于蛋白酶基因区本次调查共完成 20 个省区 168 个样本的 分析，仅发现有 2 例样本（占总样本数 1.21% ）具有轻微 耐药。 结论：当前我国 HIV 耐药性处于较低状态，对于几乎 所有药物敏感，我国抗 HIV 药物的使用如果有计划的开展， 应当会有较好的效果，但应加强治疗依从性促进工作和耐 药毒株的监测工作。 HIV 基因型耐药性检测 （序列测定法） 检 测 流 程 病人血浆标本 HIV RNA 病毒 cDNA HIV RT 和 PR 基因片段 序列测定 结果解释 RNA 提取 逆转录 PCR 扩增 特定的解释系统 标本 新鲜 EDTA 抗凝血浆，或 -80 ℃ 保存，避 免反复冻融 病毒 RNA 提取（ Qiagen 公司试剂盒 ） 裂解标本，灭活 RNA 酶 加到离心柱中， RNA 与硅胶膜结合 洗两次，去除杂质 用无 RNA 酶的缓冲液洗脱 RNA 收集 RNA 备用 优点：操作简便、快速、得率高 逆转录 RNA cDNA 反应体系： 10XBuffer 1 ? l dNTP 0.5 ? l 外侧反向引物 1 ? l RNase inhibitor 0.25 ? l M-MuLV RT