浅谈分子定向进化技术.pptxVIP

前言;一.分子定向进化技术; 2.原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有3’ 一5 ‘校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体 。分子定向进化其实是突变加筛选／选择的重复循环，且整个进化过程完全是在人为控制下进行的。 ;二.分子定向进化的选择策略; 3. DNA改组(DNA shuffling)技术，又称有性PCR(sexualPCR)或分子育种(molecular breeding)，即DNA分子的体外重组。通过DNA shufling技术，既可对单基因或DNA片段进行改组，也可对基因组或染色体等进行改组 。 ; 4.高通量筛选技术(High-Throughput Screening，HTS) 表面展示技术是筛选蛋白质突变体库的高通量筛选方法，特别在抗体的研究当中应用非常普遍，具有高效、高灵敏度等特点。目前，表面展示技术有：噬菌体表面展示技术，细菌表面展示技术，酵母表面展示技术，酵母双杂交系统，核糖体展示技术．蛋白质片断互补试验. ; （1）.噬菌体展示技术(Phage Display) 噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。人们利用这一技术可以将各种自然界或人工合成的DNA整合到丝状噬菌体基因中，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，利用噬菌体展示库所固有的基因型和表现型之间的直接关联进行检测。如抗原抗体反应，生物素结合反应等，根据反应的性质进行分离，从中筛选出人们所需的突变蛋白质。 ; （2）.细菌细胞表面展示技术(Bacterial CellSurface Display) 结合荧光激活细胞筛选仪(Fluo．rescence Activated Cell Sorting，FACS)或流式细胞筛选仪(flow cytometry)是非常有效的高通量筛选方法 . 该技术是目前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。它能够决定突变体库中每个克隆的功能特性 。;三 .分子定向进化技术的应用; 2.分子定向技术在农业中的应用 农业饲料酶制剂中的应用：通过易错PCR和DNA改组技术，获得高比活和低pH淀粉酶；碱耐受性和在碱性条件下高活性的纤维素酶 ；耐高温的纤维素酶；水解二糖的能力较野生型高31％葡聚糖内切酶；温度耐受性超过90℃，最适pH为酸性的木???糖酶。 ;3. 在蛋白质药物上的应用 对酶类药物的定向进化，主要体现在提高活性和增强稳定性上。 使用DNA改组技术对人DNA拓扑异构酶的碳末端进行定向进化。筛选到的突变体，对喜树碱的敏感性比野生型的提高了22～28倍。 对血纤维蛋白溶酶原催化抑制1(plasminogen activator inhibitor type 1．PAI一1)进行改组，筛选到的突变体的半衰期比野生型的提高了245倍，突变位点在50，56，61，70，94，150，222，223，264和331。;四.展望;Thank you!