人重组TGF-βsRII亲和核酸筛选方法的建立.docVIP

人重组TGF-βsRII亲和核酸筛选方法的建立 谢琳1，刘韧2，朱旭东3，贺翔鸽1，陈彩宇3 （第三军医大学大坪医院野战外科研究所眼科1，第三军医大学大坪医院野战外科研究所二室2，第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室3，重庆400042） 提要：目的 TGF-?II受体是阻抑TGF-?活性的良好靶点，本研究通过筛选TGF-?RII亲和核酸，旨在探寻拮抗TGF-?活性的新方法。方法 以ssDNA 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-N60-CAGACGACTCGCCCGA-3’为模板，体外转录获取初始RNA随机库；以人体外重组TGF-?sRII为靶目标蛋白行SELEX实验，共进行8轮循环筛选。通过膜结合实验监测筛选所得RNA富集库对TGF-?sRII亲和性的进化状态；凝胶阻滞实验检测亲和核酸序列与TGF-?sRII的结合强度。结果 随着筛选进行，RNA富集库沿着与靶蛋白TGF-?sRII亲和性加强的方向进化；从第8轮富集库中分离出两类优势序列，序列A和序列B。膜结合实验显示序列A 、序列B对TGF-?sRII有明显的亲和性，但凝胶阻滞实验显示序列A、序列B均无与蛋白结合的阻滞带出现。结论 以上结果提示筛选所得序列A及B 与靶蛋白TGF-?sRII的亲和性及特异性还不理想，但先导序列A及B的获得为通过后SELEX技术进一步寻找最佳结合序列奠定了基