质谱仪原理简介【爆款】.pptVIP

F、磷酸化定量分析 1、N稳定同位素标记法： N培养基 14 15 N培养基 14 2、同位素亲和标记法 细胞池1 细胞池2 混合 β消除＋氘 Β消除＋氢 亲和纯化 酶解 MS 磷酸肽或磷酸化蛋白在缄性环境下发生β消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应，亲核试剂一种为氘原子、一种为氢原子，再接上一个亲和标签（如生物素biotin），混合酶解，提取含biotin的肽段进行MS检测。 六、糖基化蛋白的鉴定 A、用糖甙内切酶切断糖链与蛋白链间的糖甘键，将反应前后的质谱图比较，可知糖链的平均质量。 B、糖基化位点的确定 先用蛋白酶酶解成含糖链和不含糖链的肽段，获得其肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶切除糖链，其肽质量指纹谱将发生变化，含糖肽段发生丢失位移，通过网上数据库检索其序列，找到位点。 C、用凝集素直接提取含糖肽段，再结合质谱技术分析 凝集素对含糖肽段有专一亲和性 * 七、质谱在蛋白质组学中的应用 A、稳定同位素代谢标记技术。前面已介绍 B、同位素亲和标签技术 ICAT 专一与Cys共价结合 优缺点 优点 1、兼容分析任何条件下的体液、细胞、组织中的绝大部分蛋白。 2、烷化反应在盐、去垢剂/稳定剂（如SDS、尿素盐酸胍等）存在下都可进行。 3、只分析含Cys残基的肽段，降低分析复杂性。 缺点 ICAT本身分子量较大（500Da左右）增加数据检索复杂性。 无法分析不含Cys的蛋白。 2DLC-MS的基本原理 Why 2D LC/MS? 可鉴定极端具有pI、疏水性、分子量的蛋白质 适合膜蛋白 重复性好 容易自动化 上样量大 高灵敏度（溶液酶切） 可根据样品灵活配置（但最后一维一般为RP） 进样部分 要求： 大气压下的样品要进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。 方式： 进样板进样 进样头进样 毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱） * C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。 1、使用基质，但基质为固体。 2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。 对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。 常用基质 1、α氰基－4羟基－肉桂酸 CCA 多肽 2、3,5－二甲氧基－4－羟基肉桂酸 SA 蛋白 3、龙胆酸（2,5－二羟基苯甲酸 DHB 聚合物 4、吡啶甲酸 PA 5、3－羟基吡啶甲酸 3HPA MALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析 常用基质结构 DHB SA CCA MALDI的优缺点 优点 1、质量数可达300,000Da。 2、attomole 至femtomole级灵敏度。 3、软电离方式，无或极少碎片离子。 4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。 5、适于分析复杂混合物。 缺点 1、分辨率低。 2、1000Da以下基质峰干扰。 3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。 4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。 5、不能分析非共价键相互作用。 6、定量时需要内校准。 7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。 8、对各种赋形剂的容忍度低（如 含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。 Sample submission In solution, as concentrated as possible, volume 10-20 ul Minimum Concentration 10 pmol/microliter Use 200ul PCR-style eppendorf tubes  The sample should NOT contain anyAzide SDSBrij 35 Tris baseCHAPS Triton X-100, Treduced Triton X-100DMSO TweenDMF ZwittergentGlycerol any other detergentPhosphate buffersSalts and buffers 100 mM The following components ar