刺参微卫星DNA分子标记的分离及筛选_图文.doc

第 21卷第 2期 大 连 水 产 学 院 学 报 Vol . 21No . 22006年 6月 JOURNAL OF DAL I A N F I SHER I ES UN I V ERSI TY Jun. 2006 文章编号 :1000-9957(2006 02-0095-05 刺参微卫星 D NA 分子标记的分离及筛选 丁 　 君 , 　 曹 　 洁 , 　 李 润 玲 , 　 孙 效 文 , 　 常 亚 青 (大连水产学院 农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室 , 辽宁 大连 116023 摘要 :采用磁珠富集法分离刺参 A postichopus japonicus 的微卫星分子标记 , 共获得阳性克隆 123个 , 其中 106个含微卫星 DNA 序列 。 分析结果表明 :完美型有 48个 , 占 45128%, 非完美型有 39个 , 占 36179%, 复合型有 19个 , 占 17192%; 重复碱基数以双核苷酸重复最常见 , 占 841, 双核苷酸 中又以 C A /GT重复所占比例最大 ; 在重复次数方面 , 3~10≥ 35次最为 常见 , 各占 39162%、 26142%和 16198%, 重复数达 5个 , 次 , 有 28个微卫星序列微卫星含量丰富 。 筛选的 2217对 , 其中 16对引物 的产物带在预测区域内出现 ; 有 7。 文中还对刺参微 卫星的特点进行分析 。 :; Q751文献标识码 :A 微卫星 DNA (M icr osatellites DNA 是指以少数几个核苷酸 (1~6个 为单位多次重复的简单序 列 。 微卫星广泛存在于真核生物基因组中 , 作为第二代分子标记手段 , 微卫星分子标记以其等位基因 突变快 、 多态性高 、 杂合度大 、 信息含量丰富 、 呈共显性等特点被广泛应用于谱系分析 、 群体遗传研 究 、 个体亲缘关系鉴定 、 遗传病鉴定 、 分子进化和生物遗传作图等方面 。 在水产动物方面 , 李琪等 [1-2] 应用杂交选择法分离出 8对皱纹盘鲍微卫星标记 , 并采用磁珠富集 法对长牡蛎的微卫星克隆进行快速分离 ; 孙效文等 [3] 采用小片段法和磁珠吸附法获得了普通鲤的微 卫星序列并进行了分析 ; 鲁翠云等 [4] 采用经典生物学方法获得了 82个鳙的微卫星序列 , 并通过 Pri m 2 er 510软件设计引物 65对 。 微卫星 DNA 分子标记的关键技术在于根据微卫星的两翼序列设计出适用的引物 。本试验中 , 作 者采用磁珠富集法分离刺参 A postichopus japonicus 的微卫星序列 , 并对其进行分析和初步筛选 , 以期 为刺参群体遗传标记研究和良种选育提供有力的分子遗传学研究工具 。 鉴于微卫星位点的侧翼序列保 守性较高 , 刺参的微卫星引物也可应用于其他相关经济棘皮动物的遗传多态性分析 。 1　 材料和方法 111　 材料 试验用刺参采自大连獐子岛附近海域 , 为野生刺参 , 体重为 150~220g 。 112　 刺参基因组 DNA 片段的制备及纯化 取刺参肌肉组织 011g, 加裂解液在 37℃ 下过夜消化 , 用 φ(酚 ∶ φ(氯仿 ∶ φ(异戊醇 =25∶ 24∶ 1混合液抽提两遍 , 透析后用无水乙醇沉淀 , 再用体积分数为 70%的乙醇清洗 , 自然干燥后溶于 011 　 收稿日期 :2006201210 　 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 ; 大连市科学技术基金资助项目 (990528 　 作者简介 :丁君 (1973- , 女 , 副研究员。 E -mail:dingjun1119@dlfu 1edu 1cn 　 通讯作者 :常亚青 , 男 , 教授。 E -mail: yqchang@dlfu 1edu 1 cn ×TE 的缓冲液中 。 取 5μg 的刺参基因组 DNA , 经 10~12U 的 Sau3A I 限制性内切酶酶切 , 用试剂盒 回收 400~900bp 的刺参基因组 DNA 片段备用 。 113　 基因组 DNA 片段同接头的连接 11311　 接头的制备 　 将两组寡核苷酸等比例混合 , 使每组的终浓度为 25μmol/L,降温条件下进行 PCR 扩增 , 最终形成的接头为 : 　　　 left 　　　 5’ G AT CGTCG ACGGT ACCG AATT CT 　　　 right 　　 3’ CAGCTGCCATGGCTT AAG AACTG 11312　 接头与片段的连接 　 建立 20μL 的反应体系 , 即加入接头 10μL, T 4DNA 连接酶 1μL, 连接 缓冲液 2μL, 刺参基因组 DNA 片段 2μL, 加水至 20μL 。