第七章 定点诱变.pptVIP

错误掺入突变指在体外DNA扩增过程中,使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件,使碱基错误掺入到新合成的基因中 Taq DNA聚合酶 无3’-5’外切活性 碱基错误掺入率10-7-10-3,20-25循环,10-3/bp 但是:突变大多数为碱基置换,有很强的倾向性.如AT→GC 碱基转换transition突变的频率是碱基颠换transversion的2倍 4. 重叠延伸剪接法 Splicing by overlap extension, SOE 可用于将两个 DNA 片段在所期望的位点进行连接。 核心:设计一对融合寡核苷酸引物 包括两个步骤：设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在 3’ 末端，起引物作用；重叠部分在 5’ 末端。与待融合的 DNA 片段序列互补。 设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补。 下图为将某基因的启动子与另一基因的编码序列连接示意图 基因A 基因B 基因B:引物的5’端部分为基因A的ATG密码子上游紧邻的序列,3’端则为基因B从ATG密码子开始的序列 基因A:基因B的融合引物与基因A的融合引物完全互补 这两个融合引物各自与侧翼引物扩增的产物有完全同源的序列,可以进行重叠延伸 基因A 基因B P1 P2 5. 大引物PCR诱变法 大引物PCR法由Kammann M等人于1989 年提出,随后经Sarkar G和Sommer S S等人加以改进。 该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物,经过2轮PCR获得突变的全长DNA。 第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增产物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。 Picard V,1994和Song-Hua Ke,1997等分别建立了单管大引物PCR(Single-tube megaprimer PCR)。单管大引物法省去第1轮PCR产物的纯化过程,实现在同一管中先后进行两轮PCR反应。Song-Hua Ke提出的方案更加巧妙简单。 需设计Tm值不同的2个侧翼引物,第1轮PCR反应用低Tm值的侧翼引物(F1)和诱变引物,用较低的退火温度,扩增反应产生大引物。然后再加入高Tm值的侧翼引物(F2)在较高的退火温度下进行第2轮的反应,扩增出全长的含突变位点的DNA产物。 单管大引物PCR诱变 6.以PCR为基础的定点诱变技术存在的问题及解决对策 1）.诱变产物的忠实性 PCR产物有相对高的错误率,除目的突变外,常包含一些非预定突变。可以通过以下2个方法将错误率降到最低。 ①限制扩增的循环数 ②应用更好的热稳定DNA聚合酶,如Pfu,Vent等,它们具有3’→5’外切酶活性,并具有校正功能 2）. 诱变的效率 提高诱变效率是以PCR为基础的定点诱变面临的问题。 通过PCR条件的优化、不同Tm值的引物的巧妙的设计、不对称扩增、把引物标记上生物素分离突变DNA等手段可以提高诱变效率。 PCR定点诱变方法的不断创新和发展使得分子生物学关于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究和基因工程中定点改造目的基因更加简便、高效、低耗。 第四节　 嵌套缺失 嵌套缺失(Nested Deletions)的制备主要依赖核酸酶,如核酸外切酶Ⅲ (ExonucleaseⅢ,ExoⅢ),BAL31或DNaseⅠ,这些酶可以特定的作用方式消化DNA,同时消化DNA的速率可控制,因此能同时分离嵌套缺失和多组终末端相差无几的缺失体 利用该技术可构建一系列梯度缺失重组子,借此可对该段DNA分子上的重要功能区进行定位,用于寻找在基因表达调控中起关键作用的启动子和增强子等顺式作用元件 1. 核酸外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ,ExoⅢ)的消化 原理：就是利用核酸外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ，ExoⅢ可特异性地切割线型双链DNA分子3’凹端产生5’突出端这一性质而进行的一种缺失反应。利用该技术可构建一系列梯度缺失重组子 A B C 2．BAL 31 的消化 主要活性：3’外切核酸酶活性，可从线性 DNA 两条链的 3’ 端去除单核苷酸。 还具有较弱的内切核酸酶活性可降解单链（单链， nick, gap），依赖 Ca2+ ，EGTA 可抑制活性。 两种活性结合产生平端或较短5’突出端的缩短分子 三、随机引发重组 （ random-priming recombination，RPR ） 原理:用一套随机引物与模板配对延伸,产生互补于模板不同位点的短DNA片段混合物,由于碱基的错配和错误引发,这些短的DNA片段中也会有少量点突变,在随后的PCR反应中,这些短的DNA片段互为引物重新组装产生全长的基因 模板:一条DNA单链或cDNA 随机引发重组的一般过程如下 (1)随机引发合成短DNA片段混合物:以变性DNA为模板