液质联用hplcmsms分析鉴定地西泮和氯硝西泮的补.docVIP

液质联用（HPLC/MS/MS）分析鉴定地西泮和氯硝西泮的补充检验方法 【鉴别】取本品适量，按照定性及含量测定项下方法试验，供试品在地西泮和氯硝西泮对照品HPCL色谱峰（保留时间）处不得有色谱峰出现，并且供试品该色谱峰液质联用的一级质谱及二级质谱均不得与对照品一致。 【定性及含量测定】本品定性分析参照液质联用法(HPLC/MS/NS)，见《中华人民共和国药典2005年版二部》附录IX J；含量测定按照高效液相色谱法，见《中华人民共和国药典2005年版二部》附录VD。 液质联用条件 使用十八烷基键合硅胶为填充剂的液相色谱柱（柱头加装相同规格填料的预色谱柱），以乙腈—0.01mol/L乙酸铵水溶液（60：40）为流动相，检测波长254nm，柱温25℃，进样量10μL，地西泮和氯硝西泮的理论塔板数均不小于2000，分离度大于1.5；质谱装配电喷雾电离源（ESI），源电压5KV，毛细管温度275 对照品溶液的制备与测定 分别精密称取地西洋和氯硝西泮对照品适量（约5mg），置于50mL容量瓶中，先加上述流动相溶液适量，超声10分钟使之溶解，放冷至室温，用流动相溶液稀释至刻度，混合均匀备用。精密吸取上述两种溶液适量并按照1：1的比例混合均匀作为贮备液。精密吸取该贮备溶液适量，用流动相溶液稀释制备地西泮和氯硝西泮浓度分别为50μg/mL，25μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，1μg/mL的系列标准溶液，分别取10μL注入液相色谱仪，进行液质联用分析，记录地西泮和氯硝西泮的液相色谱图及一级质谱与二级质谱图，依据标准溶液浓度及液相色谱紫外检测峰面积，制备标准工作曲线，建立拟合方程，计算相关系数（r值不小于0.99）。 供试品溶液的制备与测定 若供试品为片剂或丸剂，应细致研磨粉碎，然后适量（约300mg）称取加入50mL容量瓶中，先加入约45mL上述流动相溶液，超声提取10分钟，放冷室室温，加入流动相溶液定容至刻度，混和均匀;若供试品为胶囊，取内容物细致研磨粉碎，然后适量称取（约300mg）加入50mL容量瓶中，先加入约45mL上述流动相溶液，超声提取10分钟，放冷至室温，加入流动相溶液定容至刻度，混匀；若供试品为大蜜丸，称量整个蜜丸的质量，再将蜜丸粉碎成小颗粒，全部加入100mL容量瓶中，先加入约90mL上述流动相溶液，超声溶解，直至溶液中无大颗粒状物质，放冷至室温，加入流动相溶液定容至刻度，混匀；若供试品为液体，量取l0mL于50mL容量瓶中，再加入约30mL甲醇超声提取10分钟，放冷至室温，加入乙腈定容至刻度，超声混匀，置于冰箱中冷藏过夜。 上述样品溶液经过夜沉淀后取上层溶液适量，高速离心（不小于10000rpm），取上清液用上述流动相溶液稀释10～100倍，取10μL注入液相色谱仪，进行液质联用分析，记录液相色谱图及一级质谱与二级质谱图。通过与对照品液相色谱图保留时间，一级质谱及二级质谱图的对比，确定供试品中是否含有地西泮（C16H13ClN2O）或氯硝西泮（C15H10ClN3O3）；通过液相色谱图的积分峰面积，代入上述拟合方程，计算供试品中地西泮（C16H13ClN2O）或氯硝西泮（C15H10ClN3O3）的重量百分含量。 *附：地西泮和氯硝西泮结构信息 (1)中文名称：地西泮 英文名称：Diazepam CAS登已号：439-14-5 结构式： 分子式：C16H13ClN2O 精确质量：284.07 分子量：284.74 （2）中文名称：氯硝西泮 英文名称：Clonazepam CAS登记号：1622-61-3 结构式： 分子式：C15H10ClN3O3 精确质量：315.04 分子量：315.71