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腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM 操作手册 目 录 第一章 简介 1 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 第二章 应用重组腺病毒的优点 2 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 第三章 AdEasyTM 技术 3 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 12 3.1 技术概况 3 5.5.3 Western 杂交 13 3.2 AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程3 5.5.4 Southern 杂交和点杂交 13 第四章 主要流程 4 5.5.5 病毒裂解产物 PCR 14 4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 4 5.5.6 免疫测定 14 4.1.1 克隆的一般原则 4 5.5.7 功能测定 14 4.1.2 构建重组 AdEasyTM 转移载体 5 5.6 病毒颗粒在 QBI-293A 细胞中的大量扩增 15 4.2 细菌内 AdEasyTM 重组子的产生 5 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 4.2.1 共转化的一般原则 5 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 4.2.2 共转化方法 5 5.7.2 连续密度梯度离心 17 4.2.3 预期结果 5 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 4.3 AdEasyTM 重组质粒的筛选和扩增 6 5.8 病毒滴度测定 18 4.4 AdEasyTM 重组子转染 QBI-293A 细胞 6 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 4.4.1 细胞铺板 6 5.8.2 空斑测定法 20 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第五章 常用技术 8 第六章 疑难解答 22 5.1 QBI-293A 细胞培养 8 6.1 QBI-293A 细胞培养 22 5.1.1 QBI-293A 细胞的初始培养 8 6.2 感染力测定 22 5.1.2 QBI-293A 细胞的维持培养和增殖 8 6.3 转移载体克隆 23 5.1.3 QBI-293A 细胞的冻存 8 6.4 在 BJ5183 细胞中共转化和重组 24 5.2 QBI-293A 细胞的转染和病毒空斑的产生 9 6.5 转染 QBI-293A 细胞 25 5.2.1 感染 QBI-293A 细胞 9 6.6 筛选和测定 25 5.2.2 病毒空斑形成 9 6.7 在 QBI-293A 细胞中表达 26 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 6.8 重组腺病毒的扩增 26 5.3 MOI 测定 10 6.9 纯化 26 5.4 腺病毒感染力测定 10 6.10 病毒滴度测定 27 5.4.1 X-Gal 染色 11 缩写 英文全称 中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清 5 型腺病毒 cDNA Complementary DNA 互补 DNA AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体 cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋 DNA Amp Ampicillin 氨苄青霉素 CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应 β-Gal β-Galactosidase -半β乳糖苷酶 CsCl Cesium Chloride 氯化铯 bp Base Pair 碱基对 DMEM Dulbecco’ s Modified Eagle Medium DMEM 培养基 DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 Hr Hour 小时 ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复 Kan Kanamycin 卡那霉素 kb Kilobases 千碱基对 KDa KiloDaltons 千道尔顿 LB Luria-Bertani ( broth ) LB 培养基 MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点 Min Minute 分钟 MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数 mRNA Messenger RNA 信使 RNA MWC