免疫学实验二ELISA双抗夹心法.ppt

实验二、酶联免疫吸附试验 实验内容： 间接法 －－－测乙型肝炎病毒表面抗体（ HBsAb ） Enzyme linked immunosorbent assay ， ELISA 酶联免疫吸附试验（ ELISA ）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底 物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体 液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种 固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游 离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－ 抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物 （间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显 色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此 可检测待测抗原或抗体的有无及含量。 该技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。 实验原理： ? 免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测 相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原 理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗 原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化 效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有 颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的 抗原或抗体是否存在及其量的多少。 实验原理： ELISA 的测定方法包括： 双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法 间接法：检测抗体最常用的方法 竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体 生物素－亲和素系统 ELISA 法：是在 ELISA 中引入生物素或亲 和素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。 直接法 间接法 BAS-ELISA 底物 1. 已知 Ab 包被固相 2. 加待检标本 3. 加生物素标记的特异性抗体 4. 加酶标记的亲和素 5. 加底物显色 亲和素 酶 生物素 待检标本 biotin-avidin-system ，生物素 - 亲和素系统 此法敏感性更高。用于抗原抗体以及 DNA 、 RNA 的检测。 材料和试剂： 1. HBsAg 、包被液。 2. 待检人血清。 3. 酶标记的抗 HBsAb 抗体。 4.HBsAb 阳性对照血清、 HBsAb 阴性对照血清 5. 洗涤液： PH7.4 0.01mol/L PBS- 吐温 20 。 6. 底物溶液： OPD-H2O2 或 TMD-H2O2 。 7. 终止液： 2mol/L H2SO4 。 8. 酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪 酶 标 板 移 器 酶标仪 操作步骤： 1. 包被 ：将 HBsAg 用包被液作适当稀释（ 1 ： 100 ），在 96 孔反应板中每孔加 100μl ，置 37 ℃ 2h 后再移置 4 ℃ 过 夜。 2. 洗涤：将 96 孔反应板倾去包被液，用洗涤液 PBS- 吐温 20 加满各孔，置 3min, 倾去，如此反复 3 次。（前两步 已完成 ） 1. 已知抗原包被酶标板 2.1 弃去板内包被抗原 2.2 拍干 2.3 加满洗涤液（重复三次） 3. 加样 （ 1 ） 阳性对照 ：第 1 、 2 孔加 HBsAb 阳性对照血清 50μl ； （ 2 ） 阴性对照 ：第 3 、 4 孔加 HBsAb 阴性对照血清 50μl ； （ 3 ） 空白对照 ：第 5 孔加生理盐 水 100μl ； （ 4 ）余下各孔加 待检血清 50μl 。 4. 加 酶标记的抗 HBsAb 抗体 ： 除空白对照外 各孔 50μl ，充分 混匀。将即时帖覆盖于反应板上， 37 ℃ 孵育 30min 。 5. 弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置 30 秒、 再拍干，重复洗涤 5 次。 ( 操作同 2) 6. 显色 ：各孔（包括空白对照）加底物 A 液 50μl （ 1 滴），底 物 B 液 50μl （ 1 滴），置 37 ℃ 避光温育 15min 。 7. 终止反应 ：各孔加终止液 50μl （ 2mol/L H2SO4 ）。 8. 比色 ：将反应板以酶标仪 450nm 处用空白孔调零，测各孔 OD 值。 6. 显色 各孔（包括空白对照）加底物 A 液 50μl （ 1 滴），底物 B 液 50μl （ 1 滴），置 37 ℃ 避光温 育 15min 7. 终止反应 各孔加终止液 50μl （ 2mol/L H2SO4 ） OPD （邻苯二胺）经酶 作用后的显色反应 终 止 前 终 止 后 TMB 四甲基联苯胺