免疫学检测技术的基本原理分解.ppt

抗原肽 -MHC 四聚体分离技术 亲和素 抗原肽 MHC I 生物素 a n t i - C D 8 肽 - 四聚体 肽特异性 CD8T CD4T 及 B 非肽特异性 CD8T 荧光素 二、免疫细胞功能的测定 T 细胞功 能测定 B 细胞功 能测定 细胞因 子检测 T 细胞增 殖试验 迟发型超 敏反应的 检测 抗体含 量测定 溶血空 斑试验 巨噬细胞 吞噬试验 细胞毒 试验 吞噬功 能测定 51 Cr 释放法 乳酸脱氢 酶释放法 细胞染 色法 凋亡细胞 检测法 硝基蓝四 氮唑试验 生物活性 检测法 免疫学检 测法 T 细胞功 能测定 T 细胞增 殖试验 迟发型超 敏反应的 检测 T 细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种 方法检测： 1. 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核 松散及出现较多核仁； 2. 3 H-TdR 或 125 I-UdR 掺入法： 3 H-TdR 能掺入到合成的 DNA 中，用液 体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器， 易有放射性污染。 3. MTT ( 四甲基偶氮唑盐 ) 比色法： 外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试， 可导致迟发型超敏反应， T 细胞活化并释放多种细胞因子，产生 以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出， 24-48h 发 生， 72h 到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈 的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免 疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。 第 22 章 免疫学检测原理 免疫学检测 是指借助免疫学、细胞生物学、 分子生物学等理论或方法，对抗原、抗体、 免疫细胞及细胞因子等进行定性、定量检测。 临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾 病的诊断、病情检测和疗效评价等。 第一节 基于抗原 - 抗体反应的检测方法 第二节 免疫细胞检测 第三节 分子生物学技术在免疫学上的应用 本章内容 第一节 基于抗原 - 抗体反应的检测方法 一、抗原抗体反应概念 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在 合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结 合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗 体存在于血清中，故又称血清学反应。 二、抗原抗体反应的特点 1. 高度特异性 可精确区分物质间极微细的差异。 表示为 亲和力 ：一个抗原表位与相应抗体单一抗原 结合位点间的结合能力。 亲合力 ：指一个抗体分子与整个抗原大分子 间的结合强度，与抗原表位数目有关。 2. 抗原抗体结合的带现象与可见性 抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例 （等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应； 3. 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力 和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影 响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可 借助亲和层 析法纯化抗原或抗体。 抗原抗体反应的 2 个阶段 第 1 阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完 成；第 2 阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较 大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。 三、抗原抗体反应的影响因素 1. 电解质 抗原抗体等电点分别为 pH3-5 和 pH5-6 ，在中性或 弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使 它们失去一部分负电荷而相互结合； 2. 温度 通常为 37 ℃，适当提高反应温度可增加抗原与抗体 分子的碰撞机会，但 56 ℃以上可使抗原或抗体变性失活； 3. 酸碱度 抗原抗体反应的最适 pH 值在 6-8 之间， pH 值过高 或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当 pH 值接近等 电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现 凝集，导致非特异性反应。 四、抗原抗体反应检测技术的应用 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合 适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可 呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在 于血清中，故又称血清学反应。 抗原抗体反应 凝集反应 直接凝集 间接凝集 沉淀反应 免疫比浊 单向免疫扩散 双向免疫扩散 免疫电泳 蛋白芯片