基因工程四要素.pptVIP

8 、 RNA 酶 RNase ： ? RNase 的特点： ? 抗酸抗碱 , 具很广 pH 作用范围 ? 抗高温严寒(0~65℃均具活性，100℃也不能使之完全 失活） ? 抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后 又可恢复活性） ? 酶活性不需要辅助因子 ? 存在范围广 总之 ? 限制性内切酶 — 主要用于 DNA 分子的特异切割 ? DNA 甲基化酶 — 用于 DNA 分子的甲基化 ? 核酸外切酶 — 用于 DNA 和 RNA 的非特异性切割 ? 核酸聚合酶 — 用于 DNA 和 RNA 的合成 ? 核酸连接酶 — 用于 DNA 和 RNA 的连接 ? 核酸末端修饰酶 — 用于 DNA 和 RNA 的末端修饰 ? RNA 酶 --- 分解 RNA ? 其它酶类 -- 用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化， 检测等 1 、载体： 将 外源 DNA 或基因 携带入 适当 宿 主细胞（ host cell ）的工具。 二、基因克隆载体 P27 ? 2 、载体的种类 克隆载体： 携带重组 DNA 进入在宿主细胞内进行大量复制 形成大 量的基因克隆。 被克隆的基因不一定会表达 但一定被大量复 制 ? 质粒载体 — 复制起点来自一些天然质粒。 ? 噬菌体载体 — λ， P1 和 M13 、 fd 载体，复制起点来自噬菌体。 人工染色体载体 P33 ： 大 DNA 片段克隆载体 表达载体： 使目的基因表达，生产出我们需要的产物。 2 、 载体具备的条件 ? 具有较高的拷贝数 染色体复制起点 染色体外复制起 点 —— 质粒 复制起点具 种的特异性 分子量过 大可转移 性低 利于载体的制备 以指示载体或 重组 DNA 分子 是否进入宿主 细胞或筛选作 用 多克隆 位点 ( 掌握质粒载体，了解病毒克隆载体、人工染色 体载体 P28-35) 你对天然质粒了解多少？ ? （ 1 ）可转移性 F 质粒： F 因子或性因子 R 质粒：抗药性因子 Col 质粒：大肠杆菌素因子 ? （ 2 ）自主复制性 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 （ 3 ）质粒的拷贝数 ? 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒 可分为两大复制类型： ? 严紧型复制控制的质粒： 1 -- 3 拷贝，属低拷贝 型，受宿主染色体基因控制 ? 松弛型复制控制的质粒： 10-- 60 拷贝，属高拷 贝型，受宿主染色体基因控制较弱 （ 4 ）标记基因 ? A 、选择标记基因 —— 用于鉴别、指示目的 DNA （载体）是 否进入了宿主细胞（有可能是空载） P27\45 。 ? 抗生素抗性基因，使用最广泛。 ? a. 氨苄青霉素抗性基因（ Amp r ） 杀菌剂， Ampicillin 可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶 类的活性，干扰细胞分裂，杀死细胞。 Amp r 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化 β — 内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。 ? b. 四环素抗性基因（ Tet r ） 抑菌剂， Tetracycline 可结合在核糖体 30s 亚基 中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。抑 制细胞蛋白质合成，细胞停止生长。 四环素抗性基因编码一种 399 AAs 蛋白质，与细菌细 胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 ? c. 氯霉素抗性基因（ Cm r ） 抑菌剂， Chlorophenicol 可结合在核糖体 50 S 亚基上，阻止蛋白质合成。 Cm r 基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯 霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在 核糖体上。 ? d. 卡那霉素 (Kan r ) 、 新霉素 (Neo r ) 、 G418 抗性 基因 (G418 r ) 杀菌剂， Kanamycin ， Neomycin 和 G418 均属脱 氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核 糖体上，导致 mRNA 发生错读。 来自转座子 Tn5 和 Tn903 的 Kan r 抗性基因均可 使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。 ? B 、筛选标记基因（检测性标记基因） ? 用于指示外源 DNA 分子是否插入载体分子 形成了重组子（思考：空载是否生长的 问题？）。