分子生物学技术在病理学中的应用 .ppt

第三章 分子生物学技术在病理学中的应用 ; 第一节?? 原位分子杂交技术 ( in situ hybridization ，ISH );核酸分子杂交概述;杂交类型;固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。;原位分子杂交技术 （In situ hybridization, ISH);可以在组织的石蜡切片、冰冻切片、细胞印片、涂片上进行杂交，因此能结合病理形态的变化，检出细胞或组织中200-300拷贝以上的核酸序列。 属于固相核酸分子杂交的范畴 ;区别：菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交；Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Northern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。;基本方法;组织固定;常用固定剂;玻片和组织切片的处理 ;增强组织的通透性和核酸探针的穿透性;减低背景染色 ;防止RNA酶的污染;核酸分子杂交探针;核酸探针的类型;;根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针（单链DNA和双链DNA ） 、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。 cDNA （complementary DNA）探针：以RNA为模板，经逆转录酶催化按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息的方向相反，故称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。;; ;寡核苷酸探针;寡核苷酸探针;成套ISH试剂盒;原位分子杂交实验步骤：;杂交后处理;显示;对照实验和结果的判断; 荧光原位杂交;FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到DNA切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列，可对DNA定性、定位、相对定量分析. FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术。 缺点：方法费时、价格昂贵，所需设备复杂并需特殊的照相机记录暂时的信号及不能观察组织形态学等。;CISH;原位杂交的应用简介:;应用;(1)在肿瘤研究中的应用:;;;(2)组织、细胞中病毒DNA或RNA的检测;;;; (3)细胞的生物合成及遗传疾病研究中的应用;; 第二节?? 聚合酶链反应(polymerase chain reaction ，PCR);聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR);Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 1993年Mullis获得了诺贝尔化学奖. Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段;1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR; 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 ;PCR原理;反应体系：DNA模板，一种引物，四种三磷酸核苷，TaqDNA聚合酶及含 MgCL2的缓冲液。 ;循环;;;;PCR的反应动力学;PCR扩增产物;分析与鉴定;PCR反应体系与反应条件;PCR反应五要素：;PCR常见类型;5反向PCR（iverse polymerase chain reaction）：对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。 6不对称PCR:在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。 7锚定PCR（anchored polymerase chain reaction） 8着色互补试验或荧光PCR 9双温PCR（two-temperature PCR）;PCR技术的应用;人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱 法医：犯罪现场标本分析；HLA-DQ 肿