产纤维素酶细菌的筛选及培养.pdfVIP

产纤维素酶细菌的筛选及培养 一、筛选步骤 1、菌种的采集 采集山上距湿润的表层 10cm处的土壤样本 40g 左右，用研钵研成 粉末称取 1g 样本加入灭菌的 250mL锥形瓶中，加入 99mL无菌水摇匀 静置。 2、菌种初筛 （1）按照配方配制 200mL CMC培养基，取 1 X 250mL 空锥形瓶和 6 X 15mL 试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试 管包扎成一捆；取 12 套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无 菌水 121℃高压蒸汽灭菌 20min。 （2）于无菌台上倒 9 个 CMC培养基备用。 （3）另取 6 支 15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清 液）1.000mL加入 1 号试管，加无菌水 9.000mL。混匀后吸取 1.000mL 加入 2 号试管，重复上述操作，进行 6 次梯度稀释。 4 5 6 （4 ）待 CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取 10 、10 、 10 倍稀释液 0.100mL 于 CMC培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。 （5）将上述培养基置于 37℃培养箱中培养 24 小时，标记菌落并 记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及 表面纹理等）。 （6）配制 200mL 刚果红家别培养基，与三套培养皿一起 121℃灭 菌 20min。 （7）在无菌操作台上倒 3 个鉴别培养基备用。 （8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上， 37℃ 培养 24h，挑选 5 株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复 筛。 3、菌种复筛 （1）配制 500mL基础发酵培养基， 分装到 5 只 250mL的锥形瓶中， 121℃高压蒸汽灭菌 20min 。 （2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（ 2 环）， 37℃、 150r/min 下培养 2—3 天，转入 4℃冰箱保藏。 二、培养方法 1 清洗实验器具 2 灭菌 3 配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基） 4 倒平板 + 选择培养原菌（可能会用摇床） 5 稀释菌样 6 涂布平板或平板划线 7 放入 恒温箱 （调制均适宜的温度） 12-24h ，之后就可以收获 细菌了 8 观察记录（数量、分布等） 三、培养基种类及其组成 1、初筛 CMC培养基： CMC5g、蛋白胨 1 g、FeSO4·7H2O0.005 g、NaCl 0.25 g、琼脂粉 10g 于 1000mL锥形瓶中加蒸馏水至 500mL、调节 pH7．2～ 7．6，加棉塞 121℃灭菌 20min。 刚果红培养基： (NH4)2S04 2 g ，MgS04·7H20 0.5 g ，K2HP04 1 g， NaCl 0.5 g，微晶纤维素 2 g，刚果红 0.4 g，琼脂 20 g ，加水至 1000 mL。 无菌水：取 1 只 1000mL的锥形瓶，各加水 1000mL，加棉塞与 CMC培 养基一起灭菌 20 min 。另取 1 只 250mL空锥形瓶、 6 支 15mL试管和 12 套培养皿灭菌备用。 2、复筛 2 4 基础发酵培养基： 羧甲基