肿瘤细胞培养方法和培养基.pdfVIP

肝癌细胞培养 一、 培养基 1、 RPMI-1640+ 10% 胎牛血清培养基 2 、 DMEM+ 15% 胎牛血清 培养基 成分表 二、 实验前准备工作 : 操作者的皮肤、 培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。 用紫外线消毒实验室空气、 工作台面和一 些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射 30min 进 行消毒。紫外线照射 60min 可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（ 5％盐酸溶液、重鉻酸钾 120ml 、硫酸 200ml 、蒸馏水 200ml ）： （1）浸泡 :新使用或重复使用的玻璃器皿须经 5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸 30min ， 水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2 ）刷洗 :浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3 ）酸浸 :刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。 将玻璃制品完全浸泡入清洁液中 24h 。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。 （4 ）冲洗、烘干备用 :浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗 10min ，器皿需 每瓶灌满自来水、倒掉反复 10 次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗 2～3 次， 将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中， 烘干后的玻璃器皿要求干净透明， 无油烟， 不能残留任 何有害物质及化学药品等。 （5 ）包装灭菌 :器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止 消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或 金属制吸管筒、纸绳等。 2 、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH 煮沸 15 分钟， 流水冲洗， 0.5mol/L HCl 煮沸 15 分钟，流水冲洗，自来水煮沸 2 次，蒸馏水煮沸 20 分钟， 50 ℃烤干备用 3 、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管） ： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和 50℃清洗液刷洗，流水冲 洗，晾干，浸于清洁液 15 分钟，流水冲洗（ 15－20 遍） ,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡 24 小 时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（ -196 ℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结 晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分 DMSO,故在解冻应马上将其去除。 在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好， 然后将保 存管从液氮中取出，放于 37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混 匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台 （1）取一 15ml 离心管用滴管在其内滴加 5--9ml 培养液（取 8ml ）。 （2 ）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入 37℃水浴，不时摇动，使其急速融化， 30～ 60s 内完成。 （3 ）冻存管用 70 ％酒精擦拭消毒后， 打开盖子， 用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中 （用 培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来） 。 （4 ）低速离心 (1000r ／min) 5min ，去上清后再用 8ml 培养液再清洗离心一次。 （5 ）离心后倒掉上清液，在离心管