蛋白质组学,质谱,itraq.doc

蛋白质组学与抗逆性 主要内容 一、蛋白质组学概念及发展 二、蛋白质组研究方法 三、蛋白质组学在非生物逆境中的应用 1、概念 ？ 蛋白质组与基因组区别 基因组是静态的， 一个有机体发生、 发展、衰亡，不同 细胞、组织基因组 是基本稳定不变 蛋白质组是动态的， 作为基因组表达的产 物随时间、地点、环 境条件变化。 从mRNA表达水平并不能预测蛋白表达水平 蛋白质合成、降解、加工、修饰调控过程，需要蛋白质组分析 2、蛋白质组学发展历史 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白组研究中 心（Australia Proteome Analysis Facility）。 我国从1997年开始开展蛋白质组研究，是较早倡导 和开展蛋白质组学的主要国家之一。 2001年2月9日宣告成立国际人类蛋白组组织（HUPO） 2001年我国蛋白质组研究进入快速发展新阶段，设立 了“973”和“863”项目 3、蛋白质组学研究 生物学问题：蛋白质表达变化 翻译后修饰 蛋白质-蛋白质互作 其他研究内容 蛋白质组学研究的技术平台和生物信息学 ?蛋白分离技术 ?鉴定技术 ?分析软件 ?数据库 研究方法 蛋白质组学应用领域 蛋白质组学应用 Proteomics by PubMed Protemics 44,733 publications (2001--2012) 缩写名/全名 影响因子 年文章 投稿难易 一审周期 J PROTEOME RES 较难 5.113 493 较快 PROTEOMICS 较难 4.505 426 平均2月 J PROTEOMICS 4.878 301 命中率约50% 平均1月 MOL CELL PROTEOMICS 7.398 265 较难 一般,3-6周 BBA-PROTEINS PROTEOM 3.635 211 较易 平均2月 PROTEOM CLIN APPL 1.97 57 较易 较慢,6-12周 EXPERT REV PROTEOMIC 3.685 56 一般 较慢,6-12周 CURR PROTEOMICS 3.179 6 命中率约80% 12周或约稿 主要内容 一、蛋白质组学概念及发展 二、蛋白质组研究方法 三、蛋白质组学在非生物逆境中的应用 （一）经典蛋白质组学研究方法 （二）蛋白质组学新方法 （一）经典蛋白质组学研究路线 1、样品处理 通常采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行分析；也 可以进行样品预分级，对不同组分蛋白进行研究： 2、蛋白质分离技术 凝胶分离技术： ?双向凝胶电泳（2-DE） 应用最广泛、最成熟 ?双向荧光差异电泳(DIGE) 新型非凝胶电泳： ?液相色谱法（LC） ?毛细管电泳（CE） （1）双向凝胶电泳（2-DE） 第一向：等电聚焦（IEF） 根据蛋白质的电荷差异将蛋白质分离 第一向：等电聚焦（IEF） 第二向：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据蛋白质的分子量差异将蛋白质分离 第二向：SDS 蛋白质染色 考马斯亮蓝染色法、银染法、荧光染色法（Cy3，Cy5） 考马斯亮蓝染色法 银染法 一次良好的2-DE分析 染色比较 显色方法 灵敏度 优点 缺点 考染 200ng 操作简便，价格低 廉，便于后续鉴定 灵敏性差，所需 上样量大 银染 0.1ng 灵敏性好，所需样 品少 操作复杂，不利 于后续鉴定 荧光 1ng 定量定性较好，便 于后续鉴定 仪器试剂昂贵 （2）新型非凝胶电泳分离技术 克服双向（2-D）电泳中难以分离鉴定的高分子量 （100KD）、低分子量（10KD）、极酸性、极碱 性和疏水性强的蛋白进行有效分离，与质谱联用。 蛋白质组分离方法的优、缺点 类别 优点 缺点 只能分析可溶性蛋白，操 2-DE 成本低，重复性较好 作繁琐，工作量大，需要 蛋白样品量较大 可分离样品分子大小差异较大的蛋 HPLC 2D-LC 白质、低丰度蛋白质及疏水性蛋白 质，易与质谱连接，高灵敏度，分 成本高 析速度快，自动化程度高 3、蛋白质鉴定技术 蛋白质鉴定过程 （1） 图像扫描分析 胶内蛋白质酶解 蛋白点挖取 质谱分析 自动质谱点样 （3） （2） （1）凝胶图像处理 分析软件 （2）差异蛋白酶切 胶内蛋白质酶解 蛋白点挖取 （3）质谱分析 原理 质谱技术发展过程 质谱分类 ? 一级质谱(肽质量指纹图谱) ? 二级质谱 一级质谱 电喷射离子井飞行时间 质谱（ESI－TOF MS） 基质辅助激光解析飞行时间 质谱（MALDI－TOF MS） 电喷射离子井飞行时间质谱（ESI－TOF MS） 基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI－TOF MS） 肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF） 离子化的肽段经质谱仪，因相对分子质量差异而被分 离，产生含有不同峰值的肽质量指纹图谱。