色谱分类及应用领域（整理）.ppt

亲和层析-操作过程 ., * 亲和配基 酶的抑制剂: 大豆胰蛋白酶抑制剂 抗体：抗体-抗原，Ka=107-1012。单抗免疫亲和层析 A蛋白：与免疫球蛋白IgG结合。 凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。 辅酶和磷酸腺苷：辅酶I，与脱氢酶，激酶结合。 三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。Reactive Blue 2 与脱氢酶，激酶结合。 过渡金属离子:Cu2+,Ni2+,Zn2+ 组氨酸: 咪唑环，静电和疏水作用。 肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。 ., * 离子交换色谱 以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法 ., * 原理 (ion exchanger chromatography, IEC) 1st 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数m I-离子强度；A和B为常数, 均为pH的函数，在物理意义上，B为溶质的静电荷数与交换剂的离子价数之比(对于pro,一般大于10)。m?-离子强度无限大时的溶质分配系数, 为静电作用外的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。 2nd 意义：对于pro.和aa 调节I value 调节|pH – pI| value ., * 常用的离子交换树脂 葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂 ., * Source 系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 阳离子交换树脂 S系列 阴离子交换树脂 Q系列 MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为Q系列和P系列 ., * Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetase SDSStarting material Peak 2 ., * 操作 1st 恒定洗脱(Sephadex常用) 缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽 ., * 2nd 线性梯度洗脱(linear gradient elution) 线性梯度洗脱的优缺点 优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。 ., * 3 rd 阶梯洗脱法(stepwise elution) 优点：无须特殊设备，操作简单； 缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。 ., * 线性洗脱时间 定义：GH dI/dV-离子强度梯度(mol/l)，F-流动相流量(l/s). 利用GH和Ip关系图及上述方程，可算tr ., * 分离度和柱效 1st 分离度 意义：4因素可控制 2nd 柱效 意义： I+dI I mi 富集效应 ., * 应用： ., * 疏水性吸附色谱(hydrophobic interaction chromatography, HIC) 原理 1)吸附 1st pro疏水性 2nd pro稀疏水性差异 3rd 原有吸附介质的亲水性 4th 亲水性介质的改造 ., * ., * ., * 2)影响pro水化层因素 1st 水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2nd ionic strength 3rd |pH水 – pI| Value |pH水 – pI| Value? zeta电势? 水化层? 4th 增加亲水性物质 离子：SCN-，ClO4-，I- 有机物：乙二醇、丙三醇等含羟基物质 5th 表面活性剂 Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell 洗脱方法? ., * 3)、洗脱方法 降低离子强度 增加|pH – pI| [乙二醇] or [I-] [表面活性剂] 4)、富集效应 I+dI I mi ., * 分离效率和柱效 1st 分离效率 2nd 柱效 3rd 降低颗粒大小的极端重