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非编码RNA与荧光定量技术 北京阅微基因技术有限公司 ?荧光定量PCR技术原理 ?荧光定量平台应用 ?荧光定量分析方法 ?实验流程 ?成功项目案例 实时荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR技术原理 . 实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescencequantitative PCR，qPCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。 . 荧光定量PCR所使用的化学荧光可分为两种： 特异性荧光标记： TaqMan探针 非特异性荧光标记：SYBR染料 SYBR Green 工作原理 游离状态下，荧光物质发出微弱荧光。 与双链DNA有高亲和力，渗入双链DNA后荧光增强1000倍。 延伸时，荧光物质不断渗入，荧光信号累积，与产物量成正比。 延伸结束时，采集荧光信号。 TaqMan探针工作原理 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。 SYBR Green与TaqMan探针比较 SYBR GREEN TaqMan探针 优点 缺点 优点 缺点 与所有双链DNA结合， 可能存在假阳性； 使用方便 特异性强 成本高 准确度高 需要设计特异性探 成本低 引物要求高 针 通用型性好 不能用于多重反应 可做多重PCR 引物设计难度高 荧光定量PCR技术原理 系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。 荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR常用的四个概念 扩增曲线、基线、阈值、CT值 扩增曲线及扩增曲线的两种形式 左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反 映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定 阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲 线可以根据实验的需要相互转换 荧光定量PCR技术原理 基线、阈值线及CT值 ? 基线（baseline）：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号； ? 荧光阈值（threshold）：扩增曲线上人为设定的一个值，位于指数增长期。 ? 缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍； ?手动设置时，要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值； ?指数期的最初阶段。 ? CT值：PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过 的 扩增循环数。 荧光定量PCR技术原理 荧光定量平台的应用 荧光定量平台的应用 ? 检测不同样本间基因表达量的差异； 主要通过相对定量的方法实现：如：mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA的相对定量、 CNV检测等。 ? 检测样本内基因的拷贝数、病毒数量及细菌数量等； 主要通过绝对定量的方法实现。 ? SNP分型检测：TaqMan探针法、HRM法； ? 验证southern结果；基因芯片（DNA杂交）。 mRNA和microRNA简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约19– 24nt的非编码单链RNA，它是小RNA中最常见的一种， 另外还有siRNA、和piRNA miRNA通过碱基互补配 对的方式与靶基因的3’UTR（非翻译区）区部分或 完全互补，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产 物的翻译，从而起到转录后调控靶基因的表达的作 用,miRNA自身是没有功能的。 miRNA的作用机制 a) miRNA基因在PolⅡ酶作用下转录成长度 约为300～1000碱基的初级转录产物pri- miRNA；pri-miRNA在核内由RNaseⅢ Drosha酶处理后成为大约70碱基的带有 茎环结构的miRNA precursor (pre- miRNA) ； b) pre-miRNA在转运蛋白Exportin-5 的作 用下由核内转到胞质中； c)RNaseⅢDicer 进一步切割pre-miRNA产生 成熟的长度约为17～25nt的miRNA； d)成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成 RISC (RNA-induced silencing complex) 复 合体，从而引起靶mRNA的降解或者翻译 抑制。 miRNA研究的应用领域 肿瘤研究 植物研究 疾病治疗 miRNA 动物研究 干细胞研究 病毒研究 lncRNA简介 lncRNA(Longnon-codingRNA),长链非编码RNA,它是长度大于200个核苷酸 的非编码RNA,前人研究表明，lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞 周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为目前遗传研 究的热点。 lncRNA分为：反义长链非编码RNA、内含子非编码RNA