高效液相色谱原理、硬件及常见问题解决方法.docVIP

高效液相色谱 原理、硬件及 常见问题解决方法 高效液相色谱在中药分析中应用 自2000年版开始，中国药典一部收载的HPLC法含量测定308项（中药材 170项，中药成方制剂138项），2005年版HPLC法含量测定项目进一步增 加（中药材291项，中成药429项），2010年版则达到1643项（中药材 587项， 提取物26项，中成药1030项）。 1200 1000 800 600 中药材 中成药 提取物 400 200 0 2000年版 2005年版 2010年版 液相色谱原理 基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固 定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和） 的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。 关键点 ： ? 流动相 ? 固定相 ? 相互作用 液相色谱原理 ? 分离度公式 塔板数 选择性因子 容量因子 ?? = ? 4 × ? ? 1 ? × ?′ ?′ + 1 Rs：分离度；一般要求大于1.5。分离度越大越好。 N：理论塔板数；与色谱柱填料粒度、长度、均一性等相关；理论板数越高越好。 α：选择性因子；与色谱柱键合相、硅胶封端技术等相关；选择性因子越大越好。 k：容量因子；与化合物性质、流动相、键合相相关；容量因子在0-10范围内影响大。 关于分离的事实: ? 压力大小对分离度没有任何的影响! ? 压力是使用小颗粒色谱柱带来的一个负面效应! ? 压力不参与任何分离! 液相色谱原理 ? 分离度与选择性因子、理论板数及容量因子 液相色谱原理 ? 分离模式的选择 ? 根据化合物的性质：分子大小及 溶解性来选择分离的模式。 ? 一般情况下，遵循相似相容原 理。 ? 根据选定的模式进行色谱柱的选 择。 常见的高效液相色谱的分离模式 主要适用范围 色谱类型 固定相 流动相 (Mode) (Stationary Phase) (Mobile Phase) (Compound Separated) 正相色谱 (Normal-Phase) 硅胶，氨基、氰基、二 醇基键合硅胶…… 有机溶剂 在水中绝对不溶解的物 质或同分异构体 反相色谱 (Reversed- Phase) C18、C8, C2键合硅胶 …… 水/有机溶剂 中性、弱酸性、弱碱性 物质 离子对色谱 (Ion-Pair) C18、C8键合硅胶…… 水/有机溶剂 离子对试剂 离子 离子交换色谱 (Ion Exchange) 阴离子交换树脂 阳离子交换树脂 水相/缓冲盐 对离子 离子 体积排阻色谱 (Size Exclusion) 聚苯乙烯硅胶等 水相（SEC/GFC） 有机相（GPC） 大分子量化合物 聚合物 液相色谱原理 ? 色谱柱的选择 ? 根据化合物的性质：极性、酸碱 性、电离能力选择色谱柱及流动 相。 ? 一般情况下，遵循相似相溶原 理。 ? 要注意相同类型色谱柱选择性的 差异。 液相色谱原理 ? 同品牌，同型号的色谱柱获得一致的选择性 Eclipse XDB C18 - Xanthines黄嘌呤 Eclipse XDB C18 – Barbitals巴比妥 5 μm α 2，3= 1.13 mAU 35 30 25 20 15 10 20 15 10 10 5 0 5 μm α 3，2=1.20 α 5，4=1.13 α 4，3=1.97 1 2 3 4 5 min 1 2 3 4 5 6 min mAU 3.5 μm α 2，3= 1.13 35 30 25 20 15 10 5 0 3.5 μmα 3，2=1.20 α 5，4=1.14 α =1.97 4，3 1 2 3 4 5 min 1 2 3 4 5 6 min 1.8 μm α 2，3= 1.14 mAU 35 30 25 20 15 25 20 15 15 5 0 10 1.8 μm α 3，2=1.22 α 5，4=1.16 α 4，3=1.94 1 2 3 4 5 min 1 2 3 4 5 6 min 液相色谱原理 ? 只有选择相同品牌、型号的色谱柱才能获得一致的选择性 品牌1 C18 mAU 20 10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min 品牌2 C18 mAU 20 10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min 品牌3 C18 mAU 20 10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min 液相色谱原理 ? 选择性差异从哪里来？ R CH3 O Si R1 品牌1 C18键合方式 O Si CH3 CH3 品牌2 C18键合方式 O H R R O Si CH3 CH3 O Si R1 O CH3 Si R CH3 O H