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实验一 碱裂解法小量制备质粒 DNA （4 学时） 一、实验目的 1. 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的广泛应用 2. 学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和操作方法 二、实验原理 质粒（ plasmid ）是细菌细胞内的一种共价闭合环状 DNA （简称 cccDNA ）分子，作为 一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的染色体之外， 质粒 DNA 上携带了部分的基 因信息， 经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状， 能传给子代并在子代细胞中保持一 定的拷贝数， 也可丢失及在细菌之间转移。 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的， 常含抗生素抗性基因，是重组 DNA 技术中重要的载体，可通过连接外源基因构成重组体。 从宿主菌中提取质粒 DNA 是 DNA 重组技术中最基础的实验技能。质粒抽提的方法很 多，但原理和操作步骤都大同小异， 以碱裂解法最为常用。 碱裂解法提取质粒是根据质粒的 cccDNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。 使用 SDS 和强碱处理裂解细菌 细胞后，在 pH 值介于 12.0～12.5 这个范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性，然 而 cccDNA 的氢键虽会被断裂， 但两条互补链彼此相互缠绕， 仍会紧密地结合在一起。 当加 入乙酸钾溶液将 pH 值恢复至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链迅速而准确 地复性， DNA 双链又恢复原状， 重新形成天然的超螺旋分子， 并以溶解状态存在于液相中。 而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性不会那么迅速而准确，它们缠绕 形成网状结构，和不稳定的大分子 RNA ，变性的蛋白质－ SDS 复合物等一起沉淀下来，从 而可以通过离心去除。 三、试剂和器材 试剂 1. LB 液体培养基 胰蛋白胨 10g/L ，酵母抽提物 5g/L ，NaCl 10g/L ，调 pH 至 7.0 ，高压灭菌。 2. LB+Amp 培养基 LB 液体培养基内加入 50 μg/mL 的氨苄青霉素。 注意 Amp 遇高温分解， 待培养基温度低 于 60 ℃时加入。 3. 溶液Ⅰ（ 50 mM 葡萄糖 ,25 mM Tris-HCl, 10mM EDTA,pH8.0 ） 称取 0.3g Tris ，0.37g EDTA 二钠盐，用适量双蒸水溶解后用 HCl 调 pH 至 8.0，定容到 100mL ，再加入 0.99g 葡萄糖。 4. 溶液 Ⅱ（0.2 M NaOH, 1% SDS ） 称取 0.8g NaOH 和 1g SDS 溶于双蒸水，定容至 100mL ，现配现用。 5. 溶液 Ⅲ ([K +]=3M, [Ac ˉ]=5M) 取 5 mM KAc 溶液 60mL ，冰醋酸 11.5mL ， H2O 28.5mL 混匀。 6. TE 缓冲液（ 10mM pH8.0 Tris-HCl ， 1mM EDTA ） 称取 0.12g Tris ，0.037g EDTA 二钠盐 ,加适量双蒸水溶解，用 HCl 调至 pH8.0 并定容至 100mL ，高压湿热灭菌， 4℃保存备用。 7. 无水乙醇和 70% 乙醇 8. 酚 :氯仿 :异戊醇（体积比 25:24:1 ） 9. RNase A （10mg/mL ） 称取不含 DNA 酶的 RNase A 0.1g ，溶于 10mL TE 中，沸水加热 15min ，分装后贮存于 -20 ℃。 材料 携带质粒（ pET32a 质粒）的大肠杆菌 器材 灭菌锅、恒温摇床、离心机、微量移液器、制冰机、