凝胶电泳与分配层析.pptVIP

分配层析 制作人 ：聂世宁 一 概念 分配层析是利用各组分在两相中分配系数的不同，而使各组分分离的层析方法。 二 原理 由于不同溶质有不同的分配系数，移动速率不同因此可以达到分离的效果。 分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力等条件的影响，所以不同的物质在不同的条件下，其分配系数各不相同。在层析条件确定后，某溶质在确定的层析系统中的分配系数是一常数。 分配系数 　　分配色谱的狭义分配系数表达式如下： 　　K=Cs╱Cm=（Xs/Vs）╱（Xm/Vm） 　　式中Cs代表组分分子在固定相液体中的溶解度，Cm代表组分分子在流动相中的溶解度。 三 过程 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸附一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上；另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相向流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。 四 应用 分配层析包括纸层析、薄层层析和分配气相层析等方法。 一 纸层析 在纸层析中的流动相是指层析液，在毛细拉力作用下，层析液能不断由下向上流动。固定相是指被吸附在滤纸纤维之间的水分。由于纤维素上的羟基具亲水性使这部分水束缚在纤维素周围，不易扩散而成为固定相。在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经色素滤液细线时，滤液细线上的色素就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的色素分子，随层析液向上移动得快，形成的色素带集中在滤纸的上部；而分配系数小的色素分子，随层析向上移动得慢，形成的色素带集中在滤纸的下面。 纸层析设备简单，操作简便，所需样品少，分辨能力一般能达到要求，在实验室用于各种组分的分离并进行定性定量分析。但是其展开时间长，分离量小，不适用于大量组分的工业划分离生产，而且作为流动相的有机溶剂可能引起酶的变性失活。 二 薄层层析 薄层层析是将作为固定相支持物均匀的铺在支持板（一般用玻璃板）上，成为薄层。把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，利用各种组分的移动距离不同，而使各组分分离。如果支持物是固定吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，层析时是依据吸附力的不同使组分分离，则称吸附薄层层析；如果支持物是纤维素、硅藻土等，层析时主要依据分配系数的不同而使组分分离，则称分配薄层层析。薄层层析的展开时间段，分辨率比纸层析高10~100倍，既可作分析用分离0.01ug的微量样品又能做制备用分离500mg甚至更多的样品，因此薄层可以规格化制备。然而薄层层析的重现性比纸层析差，对酶等生物大分子的分离效果不理想。 凝胶电泳 概念 凝胶电泳（Gel electrophoresis） 是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。 基本原理及过程 琼脂糖凝胶电泳原理：? ?? ? 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。　? ? 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用， 这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖（62 C时熔化，因此其中的样品如D