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基因工程实验报告 姓名：杜琳颖 学号：2017051141 学院：生命科学院 专业：生化与分子 一、实验目的 学习并掌握从目的基因克隆到蛋白质表达的实验流程及原理。 二、实验流程 1 / 18 实验一、质粒提取载体DNA提取及酶切鉴定 一、实验目的 学习质粒的酶切及电泳分析。 二、实验原理 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的 DNA 分子。它具有自主 复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人 工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。 质粒 DNA 的提取是依据质粒DNA 分子较染色体DNA 分子小，且具有超螺旋共 闭合环状的特点，从而将质粒DNA 与大肠杆菌染色体 DNA 分离。现在常用的方法有： 碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、 快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异 而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质 粒 DNA 氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不 会完全分离，当 pH=4.8 的乙酸钠将其pH 调到中性时，变性的质粒 DNA 又恢复到原来 的构型，而染色体DNA 不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不 同，染色体DNA 与大分子RNA 、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。 限制性内切酶可以识别双链 DNA 特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平 末端，这样有利于DNA 片段再连接。限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切点，酶切 后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点 的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA 为 对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知 DNA 的相对分子质 量。 三、实验材料、仪器及试剂 （一）实验材料 含载体质粒pET28a 的大肠杆菌 （二）试剂 1、LB 液体培养基 2、质粒提取试剂盒(天根生物科技) 3、TBE 缓冲液 4 、点样缓冲液Loading buffer （10×） 5、琼脂糖 6、Nco Ⅰ酶，Xho Ⅰ酶(Takara) 7 、DNA 回收纯化试剂盒（天根生物科技） （三）仪器 2 / 18 1、Eppendorf 管、离心管架 2、10，50，200，1000 μL 微量加样器 3、Eppendorf 台式高速离心机 4 、电泳仪系统 5、恒温水浴箱 6、凝胶成像仪 7 、摇床等 四、实验步骤 （一）质粒提取 1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入500μ L 的平衡液BL ， 12,000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2、取1.5 mL 过夜培养的菌液（已备好），加入1.5mL 离心管中，使用12,000rpm 离 心1min，尽量吸除上清，再收集一次菌体（根据浓度选择）。 3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL 溶液P1 （请先检查是否已加入RNaseA ）， 使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 4 、向离心管中加入250μL 溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。 5、向离心管中加入350μL 溶液P3 ，立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时将 出现白色絮状沉淀。12,000rpm 离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。