周围环境中微生物观察及分离实验(0001).docVIP

微生物学实验四 周围环境中微生物观察及分离实验 生02 孙禹 2010012376 PAGE 3 周围环境中微生物观察及分离实验 生命科学学院 生02 孙禹 2010012376 实验日期：2012-3-26 同组姓名：张宇成、冯佳界 一、实验目的 1、熟悉常用微生物培养基的配制方法和原理 2、学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种 3、用平板划线法和稀释法分离微生物 4、认识微生物存在的普遍性，理解无菌操作原理 二、实验原理 1、微生物的分离与纯化 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化，常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜条件的培养条件，或加入某些抑制剂造成抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物。再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。 通过这种方法可以获得很多有价值的菌株。 2、平板菌落计数法 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。这一统计方法可以获得活菌的信息，被广泛应用与生物制品检测中。 三、实验仪器、材料和用具 实验仪器和用具：培养箱、接种环、酒精灯、打火机、平皿、涂棒、取液器（200ul、1000ul）、试管架、锥形瓶、EP管若干、记号笔 实验材料和试剂：土样10g、大肠杆菌（用于平板划线）、无菌水、牛肉膏蛋白胨培养基每小组20个 四、实验步骤 （一）、土壤中微生物的检测 1、牛肉蛋白胨培养基的配制（琼脂为2％）(已于上节课完成) 根据本组所需(共6人)，按下面配方称量试剂： 牛肉膏 6g 蛋白胨 6g 氯化钠 12g 蒸馏水 1200ml 表一 牛肉蛋白胨培养基组成 ◎最后加蒸馏水，于1200ml 蒸馏水中将上述成分充分搅拌溶解 ◎调节pH 至7.2-7.6 ◎分装于6 个三角烧瓶中，分别加入琼脂 ◎用封口膜和皮筋封好瓶口，用记号笔在瓶上标明培养基名称、组号 ◎高压、121℃灭菌20min 2、采集土样 选择肥沃土壤，去表层土，挖5~20cm深度的土壤数10g，装入烧杯，带回实验室。 3、制备土壤稀释液 称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，用手振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。(全班统一做1份,分到每个小组1ml) 用200μl的无菌吸头从中吸取0.1ml土壤悬液，注入事先分装有0.9ml无菌水的试管中，吹吸3 次，摇匀（10-3）。类推制得10-4、10-5、10-6的土壤悬液。 4、涂布 用无菌吸头，用无菌吸头，分别吸取10-6 、10-5 、10-4浓度土壤稀释液100μl，较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板。 5、培养 将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于35℃温箱中培养24h；统计所长出的菌落数。 6、菌落计数 培养24h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，换算出土样中的菌含量。 （二）E.coli平板划线 在培养皿底部标记好4-6个分区，用无菌接种环取一环菌液，在区域1内划平行线若干。 灼烧接种环杀死高浓度菌，冷却后由1区向2区均匀划平行线。照同样的方法，划线至3、4区。倒置于37℃温箱中培养24h，观察单菌落。每人使用一个培养基。 图一 平板划线示意图 （三）周围环境中微生物的检测 具体方法与上述接种微生物的方法相同，在不同培养基中分别接种： ◎空气中的微生物(培养基敞口放置30min) ◎手指上微生物(沾湿手指、冲洗手指、肥皂洗净手指) ◎自来水中微生物 ◎饮用水中的微生物(冯佳界提供) ◎纸巾和未灼烧硬币上的微生物 ◎经灼烧的硬币上的微生物 ◎咳嗽时微生物 ◎手机上微生物 五、实验结果与分析 （一）、土壤中微生物的检测结果 稀释至10-4 第一组 稀释至10-4 第二组 稀释至10-4 第三组 稀释至10-5 第一组 稀释至10-5 第二组 稀释至10-5 第三组 稀释至10-6 第一组 稀释至10-6 第二组 稀释至10-6 第三组 图二 土壤稀释液涂布结果 首先观察9个平板上微生物的生长情况，可以发现稀释浓度为10-4时能够在两组中都看到大量菌落，其余一组有较少菌落；而在稀释浓度