酶工程7催化抗体 文档资料.ppt

抗体结合部位中还含有 Lys 残基， 用于稳定负氧离子形成和识别底物的 疏水口袋。 —— 催化抗体 - 半抗原复合物的高分辨 结构证明，抗体能够把经过天然酶进 化而出现的活性部位结构会聚到一起。 Schultz 小组制备了水解甲基对硝 基苯基碳酸酯的抗体 48G7 与其半抗原 p- 硝基苯基 -4- 羧丁基磷酸酯的复合物 的晶体，并对其进行了 X- 射线衍射分 析，发现抗体结合部位的共有模块含 有碱性残基，它能与磷酸氧发生静电 相互作用产生所谓氧阴离子洞 (Oxyanion hole) 。 稳定半抗原是通过下列因素实现 的：带正电的 Arg-L96 与带负电的磷 氧基靠近，形成静电吸引；由 His- H35 ， Tyr-H33 和 Tyr-L94 与磷氧基的 氧形成的氢键。 抗体酶 48G7( 右侧 ) 与它的 磷酸酯半抗原 ( 左侧 ) 相互作用示意图 Charbonnier 等对未配位的催化 Fab ( 结合抗原的抗体片断 ) D2.3 ，它与底物类 似物的复合物以及它与磷酸酯半抗原的复 合物的 X- 射线晶体结构进行了比较，结果 完全阐明了催化机理，发现漏斗形的沟槽 使水很容易扩散至深埋抗体中的反应中心。 反应中心在碱性 pH 下通过优先稳定带负 电的氧阴离子中间体而起作用，中间体是 由羟基化物进攻 p - 硝基苯基酯底物产生的。 Lerner 小组用定点突变技术将金属离子引 入抗荧光素抗体的结合部位。半抗原 - 抗体的晶 体结构显示，轻链互补决定区中的 3 个残基在 相对几何学上类似于碳酸酐酶中锌结合部位上 的 3 个组氨酸残基，因此，用组氨酸取代抗体 残基 Arg34L 、 Ser89L 和 Ser91L 。为避免对金 属结合部位的可能的空间障碍，用亮氨酸取代 Tyr36L 。经过这样改造后的抗体不仅仍能结合 荧光素，而且还能结合 Cu(ll) 、 Zn(ll) 和 Cd(ll) 。 这种将金属结合部位引入抗体的能力十分重要， 因为金属离子可催化各种类型的反应。 定点突变法作为蛋白质工程的基 本手段之一可精确改变蛋白质肽链上 的任一氨基酸残基，因此，可用来阐 明某一氨基酸残基在抗体结合和催化 中的作用。 从鼠骨髓瘤细胞产生的一系列能 和磷酸胆碱结合的抗体已被广泛研究 过，有的还做过 X- 射线衍射结构分析， 发现重链上的两个氨基酸残基 Arg- 52H 及 Tyr-33H 在所有的能结合磷酸 胆碱的抗体中都存在，所以认为这两 个残基对抗体的结合及催化作用起关 键作用。 Jackson 等在研究能结合磷酸胆 碱的抗体 S107 时，对 Tyr-33H 和 Arg- 52H 都做了突变，分别获得 4 个 Tyr-33 突变体和 3 个 Arg-52 突变体。 一般来说， Tyr-33 的突变体催化 活力没有变化；而 Arg-52 的突变体由 于丧失了带正电侧链，催化活力显著 降低。这说明，静电相互作用对 S107 的催化作用至关重要，也说明将有催 化作用的残基引入到抗体中，可以增 加抗体酶的催化活性。 有意思的是 Tyr-33H 的突变体 (Y33H) 可使抗体活性提高 50 倍 (kcat =5.7min-1 ， Km=1.6mM) ，引入的组 氨酸可能起广义的酸碱催化作用。 用烷基磷酰胺 (phosphonamidate) 半抗原诱导产生的单抗 NPN43C9 是动 力学和催化机制研究的最多的抗体酶 之一，很适合作为突变的模型用于研 究抗体酶结构与功能的关系。 Roberts 等为了检测 NPN43C9 的 催化机理，用抗体结构数据库 (ASD) 构建了该抗体可变区的三维模型。 该模型显示 ArgL96 的胍基处于抗 原结合部位的底部，并与抗原的磷酰 胺基（该基团模拟四面体过渡态的负 电荷）形成盐桥。因此该模型预计 ArgL96 与抗体的结合与催化功能相关。 计算机模拟和实验结果都证实，催化 抗体 NPN43C9 的催化机理是稳定催化 作用中的高能过渡态。 催化抗体制备方法 催化抗体 制备方法 拷贝法 单克隆技术 天然来源分离法 基因工程 蛋白质工程 化学修饰 新的方法和技术不断出现 稳定过渡态法 1 稳定过渡态法 1986 年发表的两篇在抗体酶的实 践上有重要突破的工作，标志着抗体 酶的研究进入一个崭新的阶段。起初 的设计思想是以 Pauling 的稳定过渡