单克隆抗体制备实验过程.pdfVIP

实用标准文案 单克隆抗体制备实验过程 一、 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠， 使小鼠产生致敏 B 淋巴细胞的 过程。 一般选用 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠，按照预先制定的免疫方 案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官， 文档 实用标准文案 刺激相应 B 淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏 B 淋 巴细胞。 说明： FCA ，弗氏完全佐剂； FIA ，弗氏不完全佐剂； Quickantibody ，北京康碧泉公司研 制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为 IgM ，存在亲和力弱等缺点，慎 用。 PS：1 、一般皮下注射每个注射点注射 30-50ul 左右混有佐剂的抗 原，每只小鼠注射 6-8 个点为宜。 2 、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹 腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏 与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后，应在 96 小时内完成细胞融合，否则相 应的 B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 文档 实用标准文案 二、细胞融合 （Cell fusion ） 【材料和试剂】 （1 ）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生 长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2 ）免疫小鼠脾细胞悬液 取 3 天前加强免疫的小鼠，眼眶放 血， ?分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于 75 ％酒精中 3 ～ 5min 。无菌操作取出脾脏，置入盛有 5ml 不完全培养液的平皿中洗 涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有 5ml 不完全培养液 的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成 3～5 个小块，然后用注射器内芯 研磨。将脾脏细胞悬液移至 50ml 离心管中， 加不完全培养液 50ml ， 1000r/min 离心 5min ，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉 淀细胞重新悬浮于 10ml 不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小 鼠可得 0.5 ～2 ×108 个脾细胞。 （3 ）饲养细胞 将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射 器注射 10ml 不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注 射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部 1 分钟， 随后吸出注入的培养液。 1000r/min 离心 5-10 分钟，弃上清。先用 5ml HAT 培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加 HAT 培 养基，使细胞浓度为 2 ×105/ml ，备用。 （4 ）主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有 RPMI-1640 或 DMEM （Dulberco Modified Eagles Medium ）两种基础培养基，配好后过滤 除菌（ 0.22um