实时荧光定量PCR的原理操作及其应用课件.pptVIP

三、荧光定量 PCR 技术的应用 2 、相对定量分析及实验方案 研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何 就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于 RNA 纯 化后得率不同、 RNA 反转录为 cDNA 的效率不同等客观因素，用于定量分析的初 始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都 会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。所谓的 看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该 基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有 GAPDH 基因、β -Actin 基因， 18srRNA 基因等。因此，在做基因表达调控分析时 至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。 假定在 1 生理时期， X 基因的表达量为 X1 ；其内参基因表达量为 Y1 ； X1/Y1 就 将 1 生理时期的取样、 RNA 提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同 样在 2 生理时期， X2/Y2 就将 2 生理时期的取样、 RNA 提取、纯化、反转录等过程 的所有偏差均一化了；最后（ X1/Y1 ） / （ X2/Y2 ），所得的值就能就能较为真实 的反应在 1 、 2 生理时期， X 基因的变化情况。 常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和 De