精细版基因组文库构建.pptVIP

精选 (1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：300kbp主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。 精选 精选 精选 (2) P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs) 基础：噬菌体P1 导入宿主：体外包装和转导 载体筛选：显性选择标记 重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选 供体DNA大小：约100kbp 主要应用：大基因组分析 评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。 精选 (3)酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YACs) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS 导入宿主：转化酵母原生质体 载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复) 重组筛选：插入片段大小 供体DNA大小：2000kbp 主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠 评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。 精选 精选 第三节 文库的筛选 一.基因组DNA文库的筛选 筛选DNA文库是分离目的基因常用的方法； 在成千上万的克隆中仅极少数含目的基因，且 大多数基因的产物不具有可选择的表型特征， 因此可采用以下策略来进行筛选： (1)用特异探针进行分子杂交； (2)用免疫和生化方法来检测基因产物； (3)用特异性引物进行PCR扩增。 精选 二.cDNA的筛选 (1)最佳的cDNA文库其mRNA在细胞中高水平特异表达； (2)有的目的mRNA的丰度极低，那么就应选择其丰度相对较高的细胞来构建文库，并要计算好文库应具有的克隆数； (3)细胞中某种蛋白质的表达量常常是表明mRNA丰度的敏感指标。 精选 精选 探针的特异性可通过以下的策略来解决： ①选基因的特异序列为探针； ②长度不低于17～20Nt； ③控制退火温度。 碱基的简并性可通过以下的策略来解决： ①选用简并程度最低的序列； ②选用使用频率最高的密码子； ③简并密码子的第3个碱基可用H； ④应用混合探针； ⑤控制退火温度。 精选 三. 应用寡核苷酸探针来分离目的基因 1.寡核苷酸探针的来源 (1)从某一物种分离到的基因序列可作为另一物种的核酸探针； (2)由蛋白质保守区中相邻的6～7个氨基酸推导合成出核酸探针。 合成探针时必须考虑到： ①探针的特异性； ②碱基的简并性。 精选 四.假阳性克隆的克服 应用混合探针分离克隆基因虽取得了良好的效果，但也会产生相当数量的假阳性。克服假阳性的方法有二: (1)制备“ 猜测体(guessmer)” 探针 猜测体 探针是根据特定物种某已知蛋白的密码子使用频率，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行人工合成的低简并性寡核苷酸探针。 精选 精选 猜测体探针只要有85％的 碱基能和目的基因配对即可杂交。如连续的配对区较长(达10～12Nt),那么猜测体探针作用的强度足以鉴定出含目的基因的阳性克隆。 如错配的核苷酸均匀分散在探针分子的各部位，那么这种猜测体探针就不会和目的基因的序列杂交。 提高杂交温度，以减少假阳性。 精选 (2)PCR猜测体技术 ①测定尿酸氧化酶末端一段32aa的序列； ②根据此段顺序两侧的序列推测,合成一组引物； ③从猪肝中提取mRNA,反转录成cDNA,用以上 述引物对此cDNA进行特异扩增。 ④扩增产物连接到载体上进行克隆，并用唯一猜 测体探针进行杂交，选择阳性克隆。此猜测体 探针是按32aa序列推导猜测而来的。 ⑤分离的克隆中部为上述32aa,两端为引物序列。 ⑥用这段插入序列为探针，在严格条件下筛选 噬菌体cDNA文库。 精选 精选 五.应用差别杂交或 扣除杂交法分离克隆的目的基因 (一)差别杂交(diffential hybridization) 1.差别杂交要拥有两种细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，而另细胞群体中目的基因不表达。 2.制备两种不同的mRNA提取物。一种含一定比例目的基因mRNA的总mRNA;另一种不含目的基因mRNA的总mRNA; 3.通过这两种总mRNA为探针的平行杂交对目的基因cDN