酵母双杂[文字可编辑].ppt

酵母单双杂操作 洪灏 背景 酵母 （ Yeast ） 是一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，是一种天然 发酵剂，分布于整个自然界，它有自己的生命现象，是一种典型的兼性厌氧微生物，在有氧气和没 有氧气存在的条件下都能够存活。 酵母是单细胞微生物。它属于高等微生物的真菌类。它和人类的细胞一样，有细胞核、细胞膜、细 胞壁、线粒体、相同的酵素和代谢途经。酵母无害，容易生长，空气中、土壤中、水中体内都存在 酵母。有氧气、或者无氧气都能生存。 酵母 - 生长环境 多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如 仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。 水分 ：象细菌一样，酵母菌必须有水才能存活，但酵母需要的水分比细菌少，某些酵母能在水分极 少的环境中生长，如蜂蜜和果酱，这表明它们对渗透压有相当高的耐受性。 酸度 ：酵母菌能在 pH 值为 3-7.5 的范围内生长，最适 pH 值为 pH4.5-5.0 。 温度 ：在低于水的冰点或者高于 47 ℃ 的温度下，酵母细胞一般不能生长，最适生长温度一般在 20 ℃ ~30 ℃ 之间。 氧气 ：酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在缺氧的情况下，酵母菌 把糖分解成酒精和水。在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在时，酵母菌生长 较快。 酵母的特征： 酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或 藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为 1~5 微米 ′5~30 微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。 酵母菌具有典型的真核细胞结构 , 有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具 有微体。酵母菌的细胞形态酵母菌的细胞形态酵母菌细胞结构的显微照片酵母菌的菌落。 大多 数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起， 菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为 黑色。啤酒酵母的菌落红酵母的菌落各种酵母菌的菌落。 I Yeast Two-Hybrid System 中文方法： 酵母双杂一对一单转（诱饵和捕获分别转入 Y2HGOLD 和 Y187 ，再共培养 , 如 果是双转，则转入 Y2HGOLD ） 筛选方法： 酵母感受态细胞的制备 （ LiAc/PEG 制备法） 1 、取 -80 ℃ 25% 或者 50% 甘油保存的 Y2HGold 菌种 , 划线于 YPDA 平板上 30 ℃ 培 养 2-3 天； 2 、从新划线的 YPDA 平板上挑取直径为 2-3mm 的酵母菌落接种于 5mLYPDA 培养基中， 30 ℃ 振荡 (220rpm) 培养 16-24h ； 3 、 取 1ML 上述菌液接种种于 250mL 三角瓶中 100mLYPDA 液体培养基。 30 ℃ 振荡 220rpm 培养 16-20h ，直至 OD600=0.4 ～ 0.6 （ OD 可以适当高点也没问 题，但是最好不要超过 1.0 ）， 约 10h-12h ； 4 、将 100mL 液体培养基倒入两个 50mL 无菌的离心管中，室温， 700g 离心 5min ，弃上清； 5 、用 30mL ddH2O 重新悬浮并洗涤菌体，室温， 700g 离心 5min ，弃上清； 6 、用 1mL0.1MLiAc 重新悬浮细胞，将菌体转移至 1.5mL 离心管中，高速离心 （ 14000rpm ） 30s ； 7 、用 600μL0.1MLiAc 重新悬浮酵母细胞。震荡细胞悬浮液，取 50μL 样品加到 标记的 1.5mL 离心管中，此即为酵母感受态（ 酵母感受态需现制现用，不可 保存 ）。 中文方法 ： 酵母双杂交 体系的转化方法 ( 一对一转化遵照此 方法进行） 1 、制备酵母感受态，实验步骤同上； 2 、将 1 mL 单链载体 DNA 样品煮沸 5 min ，迅速 置于冰水中冷却； 3 、取制备好的酵母感受态， 1 4 000rpm ，离心 30s ，用微量取样器尽量除去残留的 LiAc ； 4 、往盛有酵母感受态的离心管中按表 7 加入酵 母转化所需物质： 酵母转化组分 体积 （ 50%w/v ） PEG 1.0M LiAc 单链载体 DNA （ 2. 0 ㎎ /ml ） 质粒（ 0. 1 ～ 10 μg ） ddH 2 O 240 m l 36.0 m l 25.0 m l 2.0 m l 48.0 m l Total 351 m l （样品较多时候可以先把其他的加好，最后分加入管内） 4 、漩涡离心混匀，然后置于 30 ℃气浴锅中温浴 30 分钟， 其中每隔 10 分钟混匀一次细胞； 5 、30℃