蛋白质分离、纯化实验技术原理[文字可编辑].pptVIP

Chapter 10 蛋白质分离纯化技术 ? 第一节 蛋白质分离纯化的要求及程序 ? 第二节 蛋白质分离纯化的前处理 ? 第三节 蛋白质纯化方法 一、蛋白质分离纯化的要求 1 、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作 为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能 的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析 的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和 蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2 、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物 活性。 3 、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有 不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 二、蛋白质分离纯化的一般程序 ①材料的选择和预处理 ②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） ③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离 ? 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。 第二节 蛋白质分离纯化的前处理 一、材料的选择与预处理 ? 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选 择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本 低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考 虑上述问题，只要能达到实验目的即可。 ? 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料 需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植 物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。 另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。 若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。 二、细胞的破碎 ? 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分 子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出 来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。 因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但 若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的 分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。 ? 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器 破碎或用超声波处理破碎。 ? 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和 果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂 和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维 素酶处理也能达到目的。 ? 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞 壁的骨架实际上是由共价键连接而成的肽聚糖 囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声 波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处 理（以分解肽聚糖）。 三、细胞器的分离 ? 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物 细胞还有叶绿体。 ? 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子， 为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污 染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中 分离某一物质。 ? 细胞器的分离一般采用 差速离心法 ，即将破碎后的细 胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘 露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大 小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的 不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。 四、提取 ? 组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细 胞内含物被释放出来，必须立即将其置于 一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解， 并尽可能保持原来的天然状态，避免因长 久放置造成制备物的分解破坏，这就是提 取。 （ 1 ）蛋白质的提取 ? 大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸 溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为 主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如 20-50m mol/L 的磷酸盐缓冲液（ pH7.0-7.5 ） 或 0.1mol/L Tris-HCl （ pH7.5-8.0 ）缓冲液 作提取液。 ? 对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性 较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、 稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如 乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。 （ 2 ）核酸的提取 ? DNA 和 RNA 在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的 形式存在。 ? DNA 的提取 ：一般是利用 DNA- 核蛋白（ DNP ）易 溶于 1mol/L NaCl 溶液而不溶于 0.14mol/L NaCl 溶液。 ? RNA 的提取 ：利用 RNA- 核蛋白（ RNP ）易溶于 0.14mol/L NaCl 溶液而不溶于 1mol/L NaCl 溶液 的性质，先提取得到 RNP 。 ? 提取得到 DNP 或 RNP 后，再将蛋白质除去即可得到 相应的核酸。 ? 蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。 ? 去污剂法 是利用 SDS 等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷 的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋 酸钾溶液，使 SDS- 蛋白质复合物沉淀，并使多余的 SDS 转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。 ? 有机溶剂法 是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂， 当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状 液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸